褪黑素合成酶ASMT基因啟動子和第一外顯區單核苷酸多態性與兒童孤獨癥的關聯研究☆

王力芳盧天蘭李俊鄭凡凡阮燕燕賈美香岳偉華劉靖張岱

褪黑素合成酶ASMT基因啟動子和第一外顯區單核苷酸多態性與兒童孤獨癥的關聯研究☆

王力芳*盧天蘭*李俊*鄭凡凡*阮燕燕*賈美香*岳偉華*劉靖*張岱*

目的探討參與褪黑素合成的乙酰血清素甲基轉移酶（acetylserotonin methyltransferase，ASMT）基因啟動子和第1外顯子區遺傳多態性位點與兒童孤獨癥是否關聯。方法對390例兒童孤獨癥患者和420例正常對照者的ASMT基因啟動子和第1外顯子區域進行測序。比較該區域5個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點的等位基因頻率、基因型頻率和單體型頻率在患者組與對照組之間的差異。結果患者組和對照組之間，5個SNPs（rs4446909、rs5989681、rs56690322、rs6644635、rs17149149）等位基因和基因型頻率的差異均無統計學意義（P＞0.05）。3個SNPs位點rs4446909、rs5989681和rs6644635之間存在連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）（D’值為0.85－0.98）。但此3個SNPs構成的單體型頻率在兩組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。結論本研究未發現ASMT基因啟動子和第1外顯子區域的遺傳多態性位點與兒童孤獨癥關聯，提示這些位點可能未參與中國漢族人群孤獨癥的致病。

兒童孤獨癥 ASMT基因 褪黑素 關聯研究

兒童孤獨癥是一種神經發育性疾病，遺傳度高達90%［1］。近期研究發現與神經發育有關的基因可能是孤獨癥的易感基因［2－7］。另有研究發現，孤獨癥和孤獨癥譜系障礙患者血清褪黑素和夜間尿液中褪黑素代謝產物6-sulphatoxymelatonin水平顯著低于正常兒童［8－10］。褪黑素是吲哚類神經激素，對于胎腦發育起重要作用，可避免自由基對發育期大腦的損傷［11］。乙酰血清素甲基轉移酶（acetylseroto-ninmethyltransferase，ASMT）是參與褪黑素合成最后一個過程的酶［12］，因此編碼此酶的ASMT基因受到研究者的關注，被作為孤獨癥的候選基因進行研究。既往國外研究發現，位于該基因啟動子區的2個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點rs4446909和rs5989681與孤獨癥譜系障礙關聯［13］。但是另一項研究中未能驗證此結果［14］。另有研究報道，6%～7%的孤獨癥譜系障礙患者有ASMT基因的部分微重復（microduplication），而僅有2% 的正常對照具有此微重復［15］。由于上述研究對象均為歐洲人群，且研究結果并不一致，而中國漢族人群ASMT基因與孤獨癥的關聯研究尚無相關報道。因此，本研究旨在探討中國漢族人群中孤獨癥與ASMT基因啟動子和第1外顯子區單核苷酸多態性位點的關聯。

1 對象和方法

1.1 研究對象 來自2006年1月至2009年12月間就診北京大學精神衛生研究所的兒童孤獨癥患者。入組標準：①符合美國精神障礙診斷統計手冊第四版（diagnostic and statistical manual of mental disorders，fourth edition，DSM-IV）孤獨癥診斷標準，由兩名兒童精神科主任醫師進行診斷；②克氏兒童孤獨癥評定量表（childhood autism rating scale，CARS）評分≥36分；③孤獨癥行為量表（autism behavior checklist，ABC）評分≥67分。排除標準：①Asperger綜合征、Rett綜合征和其他廣泛性發育障礙者；②符合DSM-IV診斷標準的其他軸I精神障礙診斷；③脆性X綜合征；④結節性硬化；⑤染色體異常；⑥嚴重軀體疾病患者；⑦非漢族人群。共納入390例孤獨癥患者，其中男359例，女31例，年齡1.9～16.4歲，中位數為6.3歲。

正常對照組為性別與患者組匹配的420名漢族健康成年人，男389名，女31名，年齡18～45歲，中位數為27歲。個體間無血緣關系、無嚴重軀體疾病、由精神科醫師采用非結構式臨床訪談明確正常對照無精神疾病。排除既往有精神疾病史和有精神神經疾病家族史者。兩組性別比例差異無統計學意義（χ2＝0.092，P＝0.76）。

此項研究得到北京大學精神衛生研究所倫理委員會的批準。所有研究對象均來自中國北方地區漢族人群，均于入組前詳細了解本研究的目的和程序，并簽署知情同意書。孤獨癥兒童由其法定監護人簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 全基因組DNA提取 抽取受試者外周靜脈血 5 mL，乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝，分裝血漿和血細胞后保存于－80℃冰箱，全基因組DNA采用Qiagen公司生產的小量血液基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit）提取。

1.2.2 基因型擴增 參考既往文獻報道，依據dbSNP數據庫（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／SNP／）和國際人類基因組單體型圖計劃（international HapMap project）數據庫（http：／／www.hapmap.org／），選擇位于ASMT基因啟動子和第1外顯子區域的5個SNPs。這5個SNPs包括位于ASMT基因5’非翻譯區的rs4446909、rs5989681、rs56690322、rs6644635和位于第1外顯子的錯義突變rs17149149。采用DNA直接測序法進行基因型檢測。上游引物為5′－GCTGGCATCTTGATGTTGAA－3′，下游引物為5′－CAACAATGGAACGTG AGTGTG－3′。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增反應體系為25 μL，包括10 mmoL的Tris-HCl（pH 8.3），50 mmoL的氯化鉀，1.5 mmoL的氯化鎂，200 μmoL三磷酸堿基脫氧核苷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs），上下游引物各0.3 μmoL，Taq DNA聚合酶1個單位，全基因組DNA 30 ng。PCR擴增反應條件：94°C預變性5 min，94° C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸40 s，共36個循環，最后72°C延伸7 min。取3 μL PCR擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

1.2.3 DNA測序 PCR擴增產物長586 bp（堿基對）。先使用試劑盒（Ampli Taq DNA polymerase）對PCR產物進行純化，其后使用BigDye測序試劑盒（ABI公司，美國），通過ABI 3730xl測序儀進行基因型檢測。測序結果采用DNAstar中的MegAlign軟件與標準序列進行比對。

1.2.4 統計分析 應用卡方擬合優度檢測法對每個SNP位點進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，P值大于0.05為符合HW平衡。采用Haploview4.0軟件，計算兩個SNP之間的連鎖不平衡（linkage disequi-librium，LD）D’值。D’值大于0.8被認為存在連鎖不平衡，構成連鎖不平衡塊。每個SNP等位基因和基因型頻率在患者組與正常對照組之間的差異采用皮爾森χ2分析。計算所得最小期望值小于1時，采用Fisher確切概率法。計算所得最小期望值小于5時，采用連續校正法。應用SPSS 13.0進行計算，檢驗水準ɑ＝0.05，雙側檢驗。針對本研究樣本量，采用遺傳效能計算器（genetic power calculator）（pngu. mgh.harvard.edu／～purcell／gpc／）計算統計效能。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 正常對照組和患者組中5個SNPs的基因型頻率均符合HW 平衡 （rs4446909：χ2＝2.57，P＞0.05；χ2＝0.39，P＞0.05；rs5989681：χ2＝2.50，P＞0.05；χ2＝0.03，P＞0.05；rs56690322：χ2＝0.01，P＞0.05；χ2＝0.02，P＞0.05；rs6644635：χ2＝0.10，P＞0.05；χ2＝0.55，P＞0.05；rs17149149：χ2＝0.27，P＞0.05；χ2＝0.19，P＞0.05）。

2.2 ASMT基因啟動子區域遺傳多態性在孤獨癥患者和正常對照之間的比較 患者組和對照組間5個SNP位點的基因型和等位基因頻率的差異均無統計學意義（rs4446909：χ2＝2.98，P＞0.05；χ2＝0.51，P＞0.05；rs5989681：χ2＝3.45，P＞0.05；χ2＝1.90，P＞0.05；rs56690322：χ2＝0.58，P＞0.05；χ2＝0.57，P＞0.05；rs6644635：χ2＝0.10，P＞0.05；χ2＝0.0002，P＞0.05；rs17149149：χ2＝3.79，P＞0.05； χ2＝3.63，P＞0.05）。見表1。

2.3 ASMT基因3個SNP之間的連鎖不平衡分析 由于兩個位點rs56690322和rs17149149最小等位基因頻率在正常對照組分別為 0.005和0.038，均小于0.05，因此僅計算另外3個SNPs位點rs4446909、rs5989681和rs6644635之間的連鎖不平衡情況。3個SNP之間的D’值為0.85－0.98，表明此3個SNPs位點之間存在連鎖不平衡。對這3個SNPs位點等位基因構成的單體型進行關聯分析，患者組和對照組單體型頻率的差異無統計學意義（rs4446909－rs5989681：A-Cχ2＝0.70，P＞0.05；G-Cχ2＝0.47，P＞0.05；G-Gχ2＝1.59，P＞0.05；rs5989681-rs6644635：C-Cχ2＝2.15，P＞0.05；G-C χ2＝2.63，P＞0.05；G-Tχ2＝0.005，P＞0.05；rs4446909-rs5989681-rs6644635：A-C-Cχ2＝0.91，P＞0.05；G-C-Cχ2＝0.42，P＞0.05；G-G-Cχ2＝2.96，P＞0.05；G-G-Tχ2＝0.11，P＞0.05）。見表2。

2.4 遺傳統計效能 3個常見 SNPs rs4446909、rs5989681和 rs6644635的最小等位基因頻率為0.23－0.43，故在計算統計效能時，將風險等位基因的最小等位基因頻率設為0.23；由于孤獨癥是多基因復雜疾病，故相對危險度設為1.5，經計算本研究樣本的統計效能約為75%。

3 討論

本研究采用病例對照的研究設計，對390例孤獨癥患者和420名正常對照的ASMT基因啟動子和第1外顯子區域進行測序。測序是檢測基因型的經典方法，準確率高且有助于發現新的SNPs。本研究發現，該區域5個SNPs等位基因頻率與基因型頻率在患者組與正常對照組之間的差異無統計學意義，提示ASMT基因啟動子和第1外顯子區域的遺傳多態性位點可能與中國漢族孤獨癥無關聯。

表1 兒童孤獨癥患者組與對照組ASMT5個SNPs位點基因型和等位基因頻率的比較 n（%）

表2 ASMT基因3個SNP構成的單體型頻率在患者組和對照組的比較 n（%）

本研究正常對照組和患者組中5個SNPs的基因型頻率均符合H－W平衡，表明研究樣本為隨機婚配，無明顯的自然選擇、遷移、遺傳漂變等因素對遺傳平衡的影響，樣本具有代表性。經計算本研究統計效能約為75%，說明本研究樣本量滿足關聯研究需要。

國外研究對250例孤獨癥譜系障礙患者和255名正常對照的ASMT基因進行測序，發現位于ASMT基因啟動子區域的2個SNPs位點rs4446909和rs5989681與孤獨癥關聯，且這兩個位點與外周白細胞系中ASMT基因轉錄水平降低有關。該研究還發現1例孤獨癥譜系障礙患者的rs17149149（N17K）基因型為AA，導致其編碼的第17位氨基酸由天冬酰胺變為賴氨酸；而正常對照中未發現此變異。此外，另1例患者第5外顯子與內含子交界區存在1個頻率很低的變異（IVS5＋2 T＞C）［10］。另一項研究對109例孤獨癥譜系障礙患者進行ASMT基因測序，也發現1例患者攜帶第5外顯子與內含子交界區的變異（IVS5＋2 T＞C）［13］。

與國外研究結果并不一致，本研究未發現ASMT基因啟動子和第1外顯子區SNPs與孤獨癥關聯；僅發現1名正常對照rs17149149的基因型為AA，且該基因型經反向測序進一步證實，但在兒童孤獨癥患者中均未發現此變異。本研究結果與國外研究不一致的可能原因分析如下：①不同種族之間遺傳背景不同，存在著遺傳異質性；如歐洲人群中ASMT基因啟動子區的SNP位點 rs56690322最小等位基因頻率為0.1至0.13，而在本研究中國漢族人群中卻為0.008。因此，ASMT啟動子和第1外顯子區遺傳多態性位點可能不是中國漢族人群孤獨癥的致病原因。②ASMT基因其他的遺傳變異僅僅增加了孤獨癥的患病風險。③孤獨癥具有臨床異質性，其臨床表現不盡相同，故不同研究中可能存在樣本的異質性問題。國外研究對象多為孤獨癥譜系障礙，包括孤獨癥、Asperger綜合征和未特定的廣泛性發育障礙（pervasive developmental disorder-not otherwise specified，PDD-NOS）。但本研究入組對象均為典型孤獨癥患者，減少了研究對象的異質性。

綜上所述，本研究采用病例對照的研究方法，探討ASMT基因啟動子和第1外顯子區域遺傳多態性與孤獨癥的關聯研究，結果并未發現該區域的5個SNPs與孤獨癥關聯。但本研究僅對ASMT基因啟動子和第1外顯子進行測序，而未對該基因的其他外顯子進行測序。今后的研究將進一步擴大樣本對該基因其他外顯子進行測序，以發現導致氨基酸改變的SNPs，進一步探討ASMT基因與孤獨癥是否存在關聯。

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Association study between polymorphisms in the promotor and exon 1 of ASMT and autism in a Chinese Han population.

WANG Lifang，LU Tianlan，LI Jun，ZHENG Fanfan，RUAN Yanyan，JIA Meixiang，YUE Weihua，LIU Jing，ZHANG Dai.Institute of Mental Health，Peking University；Key Laboratory of Mental Health，Ministry of Health（Peking University），No.51 Hua Yuan Bei Road，Haidian District，Beijing 100191，China.Tel：010－82801960.

ObjectiveTo investigate whether single nucleotide polymorphisms（SNPs）in ASMT（acetylserotonin methyltransferase）promotor and exon 1 were associated with autism in a Chinese Han population.MethodsThe polymorphisms in promoter and exon 1 were genotyped by direct sequencing in 390 Chinese Han individuals with autism and 420 healthy controls.Allele and genotype frequencies for each polymorphism were compared between patients and controls using Person’s chi-square analysis.Resultsour study did not detect significant differences of genotypic distribution and allele frequencies of 5 SNPs （rs4446909， rs5989681， rs56690322， rs6644635， and rs17149149）between autism patients and healthy controls（P＞0.05）.Rs4446909，rs5989681，and rs6644635 were in one linkage disequilibrium（LD）block with D’ranged from 0.85 to 0.98。However，the haplotypes constructed by these three SNP were not significantly associated with autism（P＞0.05）.ConclusionsGenetic variants in the promoter， and exon 1 of ASMT may be not significantly associated with autism in Chinese Han population.Further sequencing the other exons is needed.

Autism ASMT gene Melatonin Association study

R749.94

A

2012－01－01）

（責任編輯：文飛）

10.3969／j.issn.1002－0152.2012.03.003

☆ 國家重點基礎研究發展計劃（973計劃，編號：2010CB833905）；國家自然科學基金（編號：30870897，81071110）；北京市自然科學基金（編號7081005）

* 北京大學精神衛生研究所，衛生部精神衛生學重點實驗室（北京大學）