循環酶法雙試劑測定血清同型半胱氨酸的方法學評價

焦文學，王 潔（甘肅省隴南市第一人民醫院檢驗科 453000）

近年來研究表明，同型半胱氨酸（Hcy）與冠心病、腦卒中、彌漫性腦動脈硬化、糖尿病腎病等疾病關系甚為密切［1-2］。最早檢測Hcy是氨基酸分析法，Ueland等測定血清中Hcy，后經改良，目前常用方法為高效液相色譜法（HPLC）、熒光偏振免疫檢測法（FPIA）和酶免疫分析法（EIA）。HPLC是經典的參考方法，其操作比較復雜、試驗耗時比較長、試驗數據變異比較大，在臨床應用方面逐漸被FPIA和EIA所取代。但FPIA存在價格昂貴的缺點，EIA存在大部分操作還是手工操作，比較耗時等缺點［3］，所以兩種方法不適用于各級實驗室，尤其是基層醫療單位的推廣。近年來，由于Hcy檢測技術的發展，對其研究逐漸深入，循環酶法因為具有快速、簡便、靈敏度高，易于自動化等特點，逐漸成為適用于各級實驗室的常規檢測方法。本文對循環酶法雙試劑測定血清Hcy進行了方法學評價。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇2010年1月至2011年11月本院門診和住院的患者97例，其中男52例，女45例，年齡31～86歲，平均（41.7±10.3）歲。

1.2 儀器與試劑 日立7180型全自動生化分析儀。Hcy檢測試劑（浙江伊利康生物技術有限公司）包括試劑Ⅰ：腺苷甲硫氨酸（濃度為0.1mmol／L）、三（2－羧乙基）磷氯化氫（濃度為0.5mmol／L）、谷氨酸脫氫酶（20 k U／L）；試劑Ⅱ：Hcy水解酶（3.0 k U／L）、Hcy基轉移酶（3.0 k U／L）；2個水平的 Hcy標準液（分別為0.0和28.0μmol／L）。

1.3 測定原理 樣品中的氧化型Hcy被還原劑還原成游離型Hcy，游離型Hcy與試劑中的底物和酶發生反應引起吸光度變化，通過檢測反應中的吸光度變化的速率，可以計算出待測樣本中Hcy的濃度。

1.4 測定方法 生化分析儀基本參數設置：反應類型為速率A法；波長340 nm（主）／405 nm（副）；37℃反應10min，讀數時間23～31點，樣品量8μL，R1量125μL，R2量25μL。

1.5 方法學評價指標 進行方法的回收試驗、干擾試驗，精密度、線性范圍及方法對比試驗。

1.5.1 精密度評價 按照 NCCLS（EP5－T2）文件的評價方案，取濃度為12.0和28.0μmol／L的 Hcy質控品各一份，用循環酶法將此兩份標本每天上午、下午雙份測定，連續20 d。

1.5.2 回收試驗 向500μL血清中加入50μL的生理鹽水作為基礎樣本，測得Hcy濃度為8.5μmol／L，向同體積的血清標本中分別加入50μL的濃度為50.0和200.0μmol／L的Hcy純品，使其終濃度分別為12.3和25.9μmol／L，每一濃度作平行管。

1.5.3 線性試驗 取高值樣本用蒸餾水稀釋成5個不同濃度的樣本，每個樣本重復測定3次，計算出回歸方程Y＝a＋b X及線性誤差（相關系數）r2。

1.5.4 干擾試驗 以濃度為12.3μmol／L的 Hcy為基礎血清，加入不同濃度的干擾物，同時對相同體積的蒸餾水作為基礎樣品，同時進行測定，計算加入干擾物質后的測定結果與基礎樣本的測定結果之間的偏差。

1.5.5 方法比較 選擇 Hcy濃度在5.2～65μmol／L的臨床血清標本30份，分別用本法（Y）和酶免疫分析法（X）測定，每份樣品作雙份測定，結果取均值。

1.5.6 參考值范圍測定 選用150名體檢結果正常、肝腎功能試驗等各項理化指標正常的門診體檢者的空腹血清標本，年齡在17～63歲之間，其中，男92例，女58例。

2 結 果

2.1 精密度及回收率 結果批內CV分別為2.85%、1.88%；日間 CV 分別 為4.26%、3.19%，總 CV 分別 為6.35%、5.33%。測得其回收率為93.5%～97.7%。

2.2 線性試驗及干擾試驗 線性相關方程Y＝0.982 1 X＋0.054 7，r2＝0.999 6。干擾試驗結果表明，三酰甘油濃度小于或等于10mmol／L，血紅蛋白濃度小于或等于4.5 g／L，維生素C濃度小于或等于500 mg／L，膽紅素濃度小于或等于300 μmol／L時，血氨小于或等于70μmol／L時，偏差均小于5.0%，說明上述濃度的物質無明顯干擾。

2.3 與ELA比較 本法和ELA比較，Y＝1.040 0 X－0.549 8，r2＝0.995 9，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 參考值范圍測定 Hcy結果的頻數分布均為非正態性分布，男女之間結果差異有統計學意義（P＜0.05）。取95%置信區間確定的參考范圍為：男性4～18μmol／L，女性2～13 μmol／L。

3 討 論

Hcy是人體內含硫氨基酸的一個重要的代謝中間產物、可能是動脈粥樣硬化等心血管疾病發病的一個獨立危險因子。血漿中Hcy含量與遺傳因素、營養因素、雌激素水平、年齡因素等有關，與Hcy代謝有關的N5N10－亞甲基四氫葉酸還原酶和胱硫醚－β－合成酶的基因突變，酶活性下降，也可引起高Hcy血癥［5］。血清Hcy濃度測定近年來受到廣泛重視，本試驗所應用的酶速率法測定血清Hcy反應原理基于小分子捕獲技術SMT的S－腺苷Hcy水解酶在TCEP作用下［5］，氧化型Hcy轉化為游離型 Hcy，游離型Hcy與共價底物S－腺苷甲硫氨酸（SAM）催化反應形成甲硫氨酸與S－腺苷同型半胱氨酸（SAH）。SAH被SAH水解酶水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循環加入反應，從而放大了檢測信號。本研究取95%置信區間確定的參考范圍為：男性4～18μmol／L，女性2～13 μmol／L，與文獻［6］有一定差距。為利用酶促反應及還原性輔酶Ⅰ的變化來測定血清Hcy的一種嶄新的化學性方法，做到從免疫到化學的過渡，本法與之前所使用的循環酶法比較，以前是采用三試劑，而現在采用的是雙試劑，更適合在多種自動化分析儀上測定，靈敏度高，線性范圍寬，抗干擾因素強，精密度較好，值得各級醫院推廣使用。

［1］顧炳權，王多寧.血漿同型半胱氨酸水平及臨床診斷意義［J］.中國血液流變學雜志，2004，14（4）：630－634.

［2］肖飛，郭健.血液中同型半胱氨酸的檢測及意義［J］.臨床檢驗雜志，2000，18（1）：56－57.

［3］呂偉標，羅玲.檢測同型半胱氨酸的方法學進展和評價［J］.臨床和實驗醫學雜志，2008，7（7）：175－176.

［4］胡紅巖，劉建剛，崔云龍，等.血液同型半胱氨酸的測定方法及臨床意義［J］.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊，1999，20（6）：254－255.

［5］Roberts RF，Roberts WL.Performance characteristics of a recombinant enzymatic cycling assay for quantification of total homocysteine in serum or plasma［J］.Clin Chim Acta，2004，344（1－2）：95－99.

［6］Malinow MR，Bostom AG，Krauss RM.Homocyst（e）ine，diet，and cardiovascular diseases：a statement for healthcare professionals from the Nutrition Committee，American Heart Association［J］.Circulation，1999，99（1）：178－182.