HPLC法同時測定火絨草中木犀草苷和咖啡酸的含量

楊 梓 樊 暉 張 慧 張宇瑤 翟延君*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032

火絨草 Leontopodium Leontop odioides(wild.)Beauv.別名:老頭草、薄雪草、老艾頭。系菊科火絨草屬植物火絨草的干燥全草。夏、秋季采割，以地上全草入藥。多生于草原、山坡、地埂等處，廣泛分布于我國東北、西北、華北和西南等地。野生資源極其豐富，是我國北方民間常用中草藥之一［1］。性寒，味微苦，入腎、膀胱二經(jīng)。具有清熱涼血、消炎利尿等功效。其對流行感冒，急、慢性腎炎，尿路感染，尿血，創(chuàng)傷出血等癥狀有一定的治療作用。蒙醫(yī)用于肺熱咳嗽，咳痰不爽，肺膿瘍，喘咳，痰中帶血，感冒咳嗽的治療;藏醫(yī)用于治療流行性感冒，瘟病時疫，礦物藥中毒，砒霜中毒，肉瘤，瘡癤疔毒，出血亦可作艾炙用［2］。

李禮［3］等人在火絨草的化學(xué)成分研究中從火絨草的乙醇提取物中分離得到木犀草苷、小檗堿、阿魏酸、咖啡酸和香草酸等14種化合物。其有效成分之一咖啡酸具有止痛、抗炎癥、抗肝毒、抗?jié)兊茸饔茫c火絨草用于尿路感染有關(guān)［4］。雖然火絨草的部分活性成分已明確，但其含量測定方法尚未見報道，本實驗建立了HPLC法同時測定火絨草中木犀草苷和咖啡酸含量的方法，為其品質(zhì)評價提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)，G1379A真空脫氣機，G1311A四元梯度泵，G1313A自動進樣器，G1315A柱恒溫箱，G1315B二極管陣列檢測器，Agilent B 04.03化學(xué)工作站;AE－240電子分析天平;SHB－ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司);HN101－3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 (南通滬南科學(xué)儀器有限公司);DK－98－1型電熱恒溫水浴箱 (天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥 火絨草藥材 (購自河北安國，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為菊科火絨草屬火絨草);木犀草苷對照品:由中國藥品生物制品檢定所提供，批號為111720－200603，咖啡酸對照品:由中國藥品生物制品檢定所提供，批號為110885－200102，甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:采用Agilent TC－C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱;流動相:乙腈為流動相A，0.5%冰醋酸為流動相B，按下表進行梯度洗脫 (表1);柱溫:25℃;檢測器:DAD;檢測波長:咖啡酸的檢測波長為320nm，木犀草苷的檢測波長為350nm;流速:1 mL/min;

2.2 對照品溶液的制備 取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含29.6μg的溶液，即得。取咖啡酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含760μg的溶液，即得。

表1 流動相梯度洗脫時間表

2.3 供試品溶液的制備 取本品約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，稱定重量，超聲處理 (功率250w頻率35kHz)1小時，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10mL，回收溶劑至干，殘渣用70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察 取木犀草苷對照品溶液分別進樣5、10、15、20、25μL，記錄色譜峰面積。取咖啡酸對照品溶液分別進樣0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μL，記錄色譜峰面積。以進樣量 (ug)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)線性回歸，木犀草苷的回歸方程為Y=2070.541X+219.04，r=0.9996;咖啡酸的回歸方程為Y=5230.132X+112.57，r=0.9997。結(jié)果表明木犀草苷在0.148μg～0.74μg，咖啡酸在0.076μg～0.38μg范圍內(nèi)各峰面積與進樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性試驗 同一供試品溶液于室溫條件放置，于0、2、4、6、8h分別精密吸取5μL進樣，測定，記錄峰面積值，結(jié)果木犀草苷峰面積在8小時內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定，RSD為1.03%;咖啡酸峰面積在8小時內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定，RSD為1.67%。

2.6 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液，進樣5μL，重復(fù)進樣6次，木犀草苷峰面積RSD為0.52%;咖啡酸峰面積RSD為1.88%。結(jié)果表明，精密度良好，符合定量分析要求。2.7 重復(fù)性試驗 分別取同一批供試品，按樣品測定項下方法，重復(fù)制備樣品6次，進行測定，計算木犀草苷的平均含量RSD為1.38%;咖啡酸的平均含量RSD為1.91%。結(jié)果表明，供試品制備方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗 取已知含量的木犀草苷和咖啡酸的樣品約0.4g，共6份，分別精密加入木犀草苷和咖啡酸對照品各0.1mg，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液。按上述色譜條件進行測定，計算回收率。結(jié)果表明，木犀草苷加樣回收率為96.2%，RSD為1.13%;咖啡酸加樣回收率為98.4%，RSD為2.29%。符合定量分析要求。

2.9 樣品含量測定 取3批中試樣品，按2.3項下方法制備供試液，按上述色譜條件進行測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

本實驗首次采用高效液相色譜法同時測定火絨草中木犀草苷和咖啡酸的含量，由于提取物是由火絨草單味藥經(jīng)75%乙醇提取而成，不需要過多的處理方法，即可將指標(biāo)成分較好的分離。故本實驗采取溶劑提取法制備含測樣品。之后又比較了70%的乙醇回流提取和超聲提取法的提取效率，差別不大，而且超聲提取方法簡便，故本方法最終采用70%的乙醇超聲提取，制備供試品溶液。本實驗采用乙腈－0.5%冰醋酸作為流動相進行梯度洗脫，咖啡酸在12min左右出峰，木犀草苷在21min左右出峰，獲得良好的分離度和峰形，并分別對精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率進行了考察，結(jié)果表明本文介紹的測定方法準(zhǔn)確可靠、操作簡單、回收率合格，為火絨草藥材的質(zhì)量控制提供了實驗依據(jù)。

［1］《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編 (上冊，第2版)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996:14.

［2］劉軒，邸子真，初正云，等.火絨草的生藥學(xué)鑒定研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，11(8):217－218.

［3］李禮.火絨草的化學(xué)成分研究［D］.沈陽藥科大學(xué)，2008.

［4］董玉，馬強，那生桑，等.高效液相色譜法測定蒙藥冬葵果中咖啡酸的含量［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，33(2):117－119.

［5］國家藥典委員會.中國藥典 (一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.