傳代神經干細胞體外分化研究

李淑芳 桑小軍

包頭醫學院第一附屬醫院藥劑科，內蒙古包頭014010

神經干細胞是神經系統里面有自我增殖能力和多向分化潛能以及自我更新能力的多能干細胞，相關實驗證實可分化為神經系統的細胞［1］。本實驗從新生大鼠大腦勻漿分離培養神經干細胞，并且在普通血清內進行體外誘導分化，經證實為星形膠質細胞和神經元，為體內誘導神經元和神經膠質細胞的增殖修復神經組織探索新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

干細胞常規培養基包含DMEM/F12和B27以及表皮細胞生長因子 (EGF)、堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)。nestin抗體，NSE，GFAP通用型免疫組化試劑盒，以上材料來源于武漢博士德生物工程有限公司。新生1日齡Wistar大鼠30只，包頭醫學院動物中心提供。

1.2 細胞培養

無菌處死新生大鼠去大腦，加入胰酶和EDTA各1ml，恒溫37℃消化時間8min，使組織細胞分離，并且吸管輕輕吹打充分分離細胞，以便于計數，計數完畢后后稀釋至以1X105/ml接種細胞培養瓶內，常規DMEM/F12和B27以及表皮細胞生長因子 (EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)培養。每6天傳代1次，根據顯微鏡下計數繪圖形成生長曲線。

1.3 細胞免疫學鑒定

對連續培養的神經干細胞和分化細胞進行細胞免疫學檢測。神經干細胞檢測指標為nestin檢測，取出細胞爬片放到35 mm細胞培養皿里，PBS洗3次。4%冷的多聚甲醛固定20min，PBS洗3次。然后0.2%Triton X－100通透10 min，PBS洗3次。接著與二抗相同宿主的血清封閉30min，PBS洗3次。一抗4攝氏度濕盒內過夜，PBS洗3次。二抗室溫2h避光，PBS洗3次。最后蒸餾水洗掉PBS，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，巢蛋白在細胞質表達，呈現紅色熒光。GFAP在細胞質和表面突起呈現棕黃色。NSE在分化細胞胞質中呈現棕黃色。

2 實驗結果

培養18h通過相差顯微鏡觀察到部分細胞增殖分裂為細胞團塊，細胞團塊和數目隨時間而增加。在第24 h觀察到神經干細胞聚集，48～72h形成球形團塊，形態規則，突起不明顯。第8d可見數百細胞克隆團塊呈現懸浮集落，部分細胞緊貼培養瓶內壁，第4周時細胞克隆呈大小一致的大球形和小桑椹狀細胞克隆。細胞計數顯示傳代至第7代細胞數量平均增加67倍 (表1)。培養細胞細胞免疫熒光檢查細胞質內表達巢蛋白nestin，繼續培養反復傳代后仍然持續表達 (圖1)。10%胎牛血清誘導神經干細胞分化細胞進行HE染色，鏡下可見分化細胞多突起。免疫學顯示以NSE和GFAP陽性細胞為主 (圖2)。

表1 培養細胞計數

圖1 傳代細胞中巢蛋白表達

圖2 分化細胞免疫學顯示NSE

3 討論

神經干細胞處于未分化狀態，在一定條件下分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等神經系統細胞，神經干細胞的特殊標志物包括巢蛋白 (nestin)和波形蛋白，以及RCl抗原等。巢蛋白在神經板上皮細胞即開始表達，當神經細胞的遷移基本完成后巢蛋白的表達量開始下降，并隨神經細胞分化的完成而停止表達。巢蛋白被廣泛用于神經干細胞的鑒定。［2，3］神經元的標志蛋白NSE是神經元特異性烯醇化酶，是神經元特異性蛋白。GFAP膠質纖維酸性蛋白是存在與星形膠質細胞中的特性標志蛋白。兩種蛋白在分化細胞中的表達證實了所培養細胞克隆可以分化為神經元和星形膠質細胞。上述實驗結果證實了所培養的神經細胞克隆具有自我更新能力和多向分化潛能，具備神經干細胞生物學屬性。

相關實驗證實一定濃度的EGF對神經前體細胞的增殖具有調節作用，可以促進增殖［4］。本實驗所培養的細胞形態學觀察呈圓形或者橢圓形，體積較小，核質比大，經過HE染色鏡下課件對稱性核分裂像，細胞克隆可傳代7代以上。分化細胞為神經元和星形膠質細胞。在此基礎下一步擬進行神經元損傷的體內誘導分化和功能修復的研究。

［1］Ernst C，Christie BR.The putative neural stem cell marker，nestin，is expressed in heterogeneous cell types in the adult rat neocortex［J］.Neuroscience，2006，138(1):183－188.

［2］Sung CS，Wen ZH，Chang WK，et al.Inhibition of p38 mitogen－activated protein kinase attenuates interleukin－1［beta］－induced thermal hyperalgesia and inducible nitric oxide synthase expression in the spinal cord［J］.Neurochemistry，2005，94(3):742 －752.

［3］Claire Boissart，Xavier Nissan，Karine Giraud － Triboult，Marc Peschanski，and Alexandra Benchouaetal，miR － 125 potentiates early neural specification of human embryonic stem cells.Development and stem cells［J］.2012，139:1247－1257.

［4］Jing Zhou，Gayatri Shrikhande，Jing Xu，Renée M.McKay，Dennis K.Burns，Jane E.Johnson，and Luis F.Parada Tsc1 mutant neural stem/progenitor cells exhibit migration deficits and give rise to subependymal lesions in the lateral ventricle［J］.Research Communications，2011，25:1595 － 1600.