哮喘大鼠肺組織TGF-β1 與Smad3、Smad7蛋白的變化及不同中醫治法對其的影響

許朝霞 李學良 錢鵬 李娜 燕海霞 郭睿 郝一鳴 陳理君

支氣管哮喘的發病機制尚未完全闡明。研究證實，轉化生長因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)在參與上皮炎癥損傷后修復的同時也參與氣道重建的發生［1-3］。Smads 蛋白是TGF-β 的下游信號轉導蛋白，介導TGF-β 的胞內信號轉導，在哮喘氣道重建形成中發揮重要的作用。其中Smad3蛋白參與TGF-β1 的信號轉導，起正調節作用，促進TGF-β1 的生物學表達活性，從而促進氣道重塑的發生發展，而Smad7 蛋白在參與TGF-β1 的信號轉導過程中起負調節作用，抑制TGF-β1 的生物學表達活性，從而抑制氣道重塑的發生發展［4］。本研究觀察哮喘大鼠氣道重建中支氣管肺組織的形態學變化及其TGF-β1 與Smad3、Smad7 蛋白的表達，并分析固本、宣肺、宣肺固本三種中醫治法對其的影響，以期探索三種中醫治法治療哮喘的作用及機制。

1 材料與方法

1．1 動物分組

60 只雄性SD 大鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號:SCXK 滬2007-0005)，體重(200±20)g，隨機分成正常組、模型組、地塞米松干預組、宣肺方干預組、固本方干預組、宣肺固本方干預組，每組10 只。

1．2 試劑及儀器

DAB、SABC 試劑盒、羊抗兔IgG 武漢博士德生物工程有限公司，顯微鏡(OLYMPUS1X71)及其圖像分析系統。

1．3 造模方法

介紹的造模方法［5-6］進行改良。分組后，分別于第1 天、7 天，模型組、地塞米松干預組、宣肺方干預組、固本方干預組、宣肺固本方干預組每只大鼠腹腔注射致敏液1 ml，其中含卵蛋白(Ovalbuminj，OVA)100 mg，氫氧化鋁100 mg。第15 天始，激發引喘，每天1%OVA 40 ml/20 min 霧化吸入，連續28 天。相同時間點，正常組大鼠以生理鹽水替代OVA 進行腹腔注射及霧化吸入，連續28 天。

1．4 藥物干預

地塞米松片(上海信誼藥廠有限公司，批號:H31020793-01)用生理鹽水制成濃度為0．32 mg/ml的混懸液。

宣肺方由麻黃4 g、法半夏9 g、地龍9 g、柴胡9 g、黃芩9 g、葶藶子9 g 組成。固本方由生地黃10 g、熟地黃10 g、黨參10 g、茯苓9 g、黃精9 g、玉竹9 g、淫羊藿9 g 組成。宣肺固本方由生地黃10 g、熟地黃10 g、黨參10 g、澤瀉10 g、黃精10 g、淫羊藿10 g、南沙參9 g、北沙參9 g、法半夏9 g、地龍9 g、黃芩9 g 組成。分別將三方加水浸泡1 小時，頭煎加水為總藥量的10 倍，二煎加水為總藥量的4 倍，取汁棄渣，合并兩次藥汁，蒸發濃縮至生藥濃度為3 g/ml溶液(藥物的湯劑由本課題組自煎)。

于激發引喘后第一天開始進行藥物干預:正常組、模型組生理鹽水灌胃1 次/天，地塞米松干預組地塞米松混懸液灌胃1 次/天，宣肺方干預組、固本方干預組、宣肺固本方干預組分別以宣肺方、固本方、宣肺固本方水煎液灌胃1 次/天，6 組大鼠灌胃的劑量均為10 ml/kg。干預4 周后取材，檢測相關指標。

1．5 指標檢測

1．5．1 標本的采集及制備 各組分別于造模結束日處死大鼠，開胸暴露肺臟，將右支氣管肺組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24 小時后，將肺組織橫切成3 mm 厚的薄片，繼續用4%多聚甲醛固定72 小時，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟定向包埋，連續切片，厚度6 μm。用于免疫組化方法檢測。

1．5．2 免疫組化實驗步驟 取支氣管肺組織切片，用免疫組化法進行檢測，按試劑盒說明操作:切片脫蠟至水，3%過氧化氫阻斷10 分鐘，浸入檸檬酸，微波爐加熱至沸，抗原修復，山羊血封閉20 分鐘，一抗4 ℃孵育過夜，生物素化二抗37 ℃孵育30 分鐘，加SABC 試劑37 ℃孵育30 分鐘，DAB 鏡下控制染色，蘇木素復染0．5 分鐘，鹽酸酒精分化，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察支氣管肺組織著色情況。

1．5．3 結果判定 (1)治療結束后處死大鼠，取出全肺稱重。肺系數=肺重量(g)/身體重量(kg)。比較各組大鼠肺系數的變化。(2)免疫組化染色后大鼠的支氣管肺組織切片中均見棕黃色的免疫陽性反應，陽性表達主要集中在氣道上皮細胞、黏膜下、平滑肌肌層。以圖像分析系統測定灰度值，取陽性率面積占總面積的百分比值作比較。

1．6 統計學處理

2 結果

2．1 大鼠一般情況觀察

造模前各組大鼠性別、體重、月齡及健康狀況無差異。致敏的兩周內，模型組、地塞米松干預組及三種中藥治療組大鼠的體重增長較正常組少。除正常組外，其他各組大鼠在引喘后會出現呼吸急促，喉間有痰鳴音;至引喘1 ～2 周后，會出現唇及趾末端輕度發紺，但中藥治療組稍好于模型組和地塞米松組。引喘后，哮喘大鼠體重增長緩慢，尤以地塞米松組為甚。正常組大鼠精神活動未見異常，其余各組大鼠喜抱團而眠，活動較正常組欠活躍。引喘并藥物干預1 周后，宣肺、宣肺固本組大鼠大便量較其他組多，稍較軟。飲食未見明顯變化。

2．2 各組大鼠肺系數的比較

模型組和地塞米松干預組大鼠肺系數比正常組升高，差異有統計學意義(P ＜0．05);三個中藥干預組大鼠肺系數比正常組升高，差異無統計學意義(P ＞0．05);三個中藥干預組大鼠肺系數比地塞米松干預組低，差異具有統計學意義(P ＜0．05);三個中藥干預組大鼠肺系數比模型組低，但差異無統計學意義(P ＞0．05)。詳見表1。

表1 各組大鼠肺系數比較

表1 各組大鼠肺系數比較

注:與正常組比較，aP ＜0．05;與地塞米松干預組比較，bP ＜0．05

組別 n 肺系數正常組 10 7．3306±1．1359b模型組 9 9．1493±1．8564a地塞米松干預組 9 10．4569±1．5721a宣肺方干預組 9 8．3216±1．1054b固本方干預組 10 8．5209±1．7753b宣肺固本方干預組 10 8．1388±1．8997b

2．3 各組大鼠支氣管肺組織切片中TGF-β1 與Smad3、Smad7 蛋白表達水平

模型組、地塞米松干預組及三個中藥干預組大鼠支氣管肺組織切片中TGF-β1、Smad7 蛋白表達的灰度值的百分比正常組高，而Smad3 蛋白表達則比正常組低，差異均具有統計學意義(P ＜0．05);宣肺固本干預組TGF-β1 的表達比模型組低，Smad3 蛋白的表達比模型組高，差異均具有統計學意義(P ＜0．05);地塞米松組、宣肺方干預組、宣肺固本方干預組Smad7 蛋白的表達比模型組高，差異有統計學意義(P ＜0．05);宣肺固本方組TGF-β1 表達比地塞米松組低，而Smad3 蛋白的表達比地塞米松組高，差異均具有統計學意義(P ＜0．05);模型組Smad7蛋白比地塞米松組高，差異具有統計學意義(P ＜0.05)。詳見表2。

3 討論

氣道重建是哮喘發病的重要特征之一，是導致氣道不可逆性阻塞和氣道高反應性的主要病理基礎，與哮喘的持續、嚴重程度、預后及治療反應等密切相關。抑制氣道重建已經成為中醫藥防治哮喘的新策略［7］。TGF-β 是一種多功能細胞調節因子，以自分泌、旁分泌和內分泌的方式通過細胞表面的受體信號轉導途徑調控細胞的增殖、分泌和凋亡［8］。多種細胞均可產生TGF-β，氣道上皮細胞為其主要來源。TGF-β 具有多重作用，包括促進炎性細胞分化、增殖，促進氣道平滑肌增生、肥大［9-10］。在哮喘的發病過程中，TGF-β1 主要來源于肺局部浸潤的嗜酸性粒細胞和氣道壁的成纖維細胞［11］。研究［12-14］顯示，TGF-β1 在氣道重建中發揮重要作用，可加重上皮細胞受損，促進氣道平滑肌細胞、肌成纖維細胞增殖，進而直接參與哮喘氣道炎癥和重建的發生、發展過程。Smads 蛋白是TGF-β 家族的特異性細胞內信號轉導分子，在參與維持細胞的正常生理功能中發揮著重要的作用。

Smad3 蛋白是共同通路型蛋白，是所有TGF-β家族信號轉位入細胞核所必需的，Smad7 是抑制性蛋白，可與激活的I 型受體結合，抑制TGF-β 家族的信號轉導。TGF-β/Smad 信號通路是TGF-β 發揮生物學作用的重要通路，研究證實［15-16］，Smads蛋白家族可能在哺乳動物細胞內充當TGF-β1 信號的介導子，TGF-β1 主要通過TGF-β1/Smads 途徑發揮生物學效應，活性的TGF-β1 結合并激活Ⅱ型/Ⅰ型的Smad3 和Smad4，然后其聚集成共同復合物或形成數個異源二聚體，進入細胞核內與特異的DNA 連接蛋白結合，直接啟動靶基因轉錄，從而引起氣道和血管的平滑肌細胞增殖及表型轉化等一系列變化;在此過程中Smad6 和Smad7 蛋白能夠抑制其信號轉導［17］，進而調節α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達。

中醫學認為，哮喘緩解期多累及肺脾腎三臟，多表現為氣虛與陰陽失調，治療當補肺益腎、溫陽填精。本研究中宣肺方由麻黃、黃芩、柴胡、地龍、半夏、葶藶子組成，有宣肺平喘、化痰止咳、清肺解痙之功，能較好地緩解哮喘發作，是哮喘發作期的有效驗方。固本方由熟地黃、黃精、生地黃、黨參、仙靈脾組成，起到肺脾腎三補，氣血陰陽兼顧的作用，重在調節機體的免疫抗病能力。宣肺固本方兩者兼之，攻補兼施。筆者在此基礎上，本著整體觀念的思維，進一步整合治療方法，將“宣肺固本”與“宣肺”、“固本”治法進行比較，以選擇更為有效的哮喘治法。

表2 各組大鼠TGF-β1 與Smad3、Smad7 蛋白表達的灰度值比較

表2 各組大鼠TGF-β1 與Smad3、Smad7 蛋白表達的灰度值比較

注:與正常組比較:aP ＜0．05，與模型組比較:bP ＜0．05，與地塞米松干預組組比較:cP ＜0．05。

組別 n TGF-β1(%) Smad7(%) Smad3(%)正常組 8 0．0601±0．0163bc 0．0303±0．0112bc 0．1325±0．0401bc模型組 7 0．1033±0．0164a 0．0900±0．0264ac 0．0737±0．0207a地塞米松干預組 7 0．0986±0．0126a 0．0647±0．0341ab 0．0814±0．0213a宣肺方干預組 8 0．0974±0．0151a 0．0607±0．0159ab 0．0933±0．0224a固本方干預組 8 0．0955±0．0130a 0．0746±0．0252a 0．0825±0．0222a宣肺固本方干預組 8 0．0815±0．0179abc 0．0629±0．0179ab 0．1097±0．0331abc

利用卵蛋白復制哮喘模型的方法已經得到廣泛的認可和應用，延長OVA 激發時間制備大鼠慢性哮喘模型，氣道不僅存在慢性炎癥，而且有氣道重建的改變［6］。因為TGF-β1 的表達反映大鼠氣道上皮細胞的損傷程度及炎癥的發生發展情況，而Smad3、Smad7 蛋白在TGF-β1 的生物功能中發揮重要的調節作用，因此，本研究通過觀察中藥對哮喘大鼠肺組織中TGF-β1 和Smad3、Smad7 蛋白的影響，以期探討TGF-β1 和Smad3、Smad7 蛋白在哮喘大鼠氣道重建中的作用及宣肺固本治法治療哮喘大鼠的作用機制。本研究結果表明:(1)各哮喘組大鼠的肺系數較正常組均有不同程度的升高，但三個中藥治療組大鼠的肺系數與正常組間差異無統計學意義，而與地塞米松組間差異有統計學意義。臟器系數的變化常可較好地反映藥物對該臟器的毒性綜合情況，可旁證病理組織學改變的可能性［18］。(2)哮喘大鼠支氣管肺組織中TGF-β1 和Smad3 蛋白的表達水平升高，而Smad7 蛋白的表達下降，三種中醫治法對其均有影響，其中宣肺固本方能更明顯調節TGF-β1 和Smad3、Smad7 蛋白的表達，其結果與地塞米松組和模型組間差異有統計學意義。結果提示，TGF-β1 和Smad3、Smad7 蛋白與哮喘大鼠氣道重建有一定的相關性;中醫宣肺固本法治療哮喘氣道重建可能與調節TGF-β1 和Smad3、Smad7 蛋白的表達水平有關，但中藥如何通過對TGF-β1/Smads 通路的調節來影響哮喘氣道炎癥的途徑還有待進一步探究。

參 考 文 獻

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