乳源酪蛋白糖巨肽改善炎癥性腸病的研究進展

朱晨晨，陳慶森*

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

乳源酪蛋白糖巨肽改善炎癥性腸病的研究進展

朱晨晨，陳慶森*

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

乳源酪蛋白糖巨肽(CGMP)主要是κ-酪蛋白經凝乳酶降解產生的一類含有糖鏈的多肽，具有許多的生理活性功能和獨特的營養特性，可廣泛地應用于保健食品和醫藥品。本文首先概括CGMP的來源、結構特點及其研究開發現狀，從炎癥性腸病(IBD)的免疫病理機制的角度，對本實驗室和國外在CGMP調理、改善和治療IBD的相關研究進行系統地介紹，提出CGMP在一定程度上為IBD的生物免疫治療提供了新的途徑以及展示其廣闊的開發前景。

酪蛋白糖巨肽(CGMP)；炎癥性腸病(IBD)；免疫調節；腸道菌群

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)主要包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn,s disease，CD)，是一組病因未明的慢性腸道炎癥性疾病，具有遺傳易感性。目前大多學者認為腸壁黏膜免疫調節異常、持續的腸道感染、腸壁黏膜屏障缺損、致病菌和有益菌之間的平衡失調，遺傳和環境等因素共同參與了疾病的發生、發展進程[1-2]。臨床上對IBD患者的藥物治療包括5-氨基水楊酸、糖皮質激素、抗生素和免疫抑制劑，但療效并不令人滿意，且毒副作用較大，復發率較高，因此開發一種有效的營養治療方案成為了該領域的研究熱點。

酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide，CGMP)是一種來源于牛乳κ-酪蛋白的生物活性肽，不含芳香族氨基酸，可作為苯丙酮酸尿癥(PKU)患者的營養食品。此外，CGMP諸多的生物活性已得到證實，如抗微生物毒素[3]、促益生菌增殖[4-5]以及免疫調節[6-7]等活性，目前已有許多學者陸續地對CGMP的免疫調節作用進行探索性的研究，但國內關于其改善和治療IBD的研究還未見相關報道。本文首先概括CGMP的來源、結構特點及其研究開發現狀，從炎癥性腸病的免疫病理機制的角度，結合本實驗室和國外學者最新的研究成果，對酪蛋白糖巨肽調理、改善和治療IBD的相關研究進行系統地介紹，提出CGMP在一定程度上為IBD的生物免疫治療提供了新的途徑以及展示其廣闊的開發前景。

1 CGMP的來源、結構性質及其研究開發現狀

1.1 來源

酪蛋白糖巨肽(CGMP)于1953年開始被研究，Alais等[8]在研究凝乳酶對牛奶酪蛋白溶液的作用時，發現經酶處理后的牛乳以及酪蛋白鹽溶液，在12%三氯乙酸溶液的可溶性氮含量明顯增加。1956年，Waugh等[9]發現了酪蛋白。1965年，Delfour等[10]發現，利用凝乳酶切斷κ-酪蛋白的105苯丙氨酸106甲硫氨酸部位，產生不溶的副κ-酪蛋白和TCA可溶的多肽兩部分。通常此可溶性的多肽有30%～50%是以糖基化的形式存在，因此被稱為“糖巨肽”，而酪蛋白來源的此類肽則統稱為酪蛋白糖巨肽(CGMP)。

1.2 化學結構及特點

κ-酪蛋白來源的CGMP的氨基酸序列現已研究清楚[11]，它是從κ-酪蛋白的N末端106位甲硫氨酸(Met)開始至169位C末端纈氨酸(Val)結束的64個氨基酸殘基構成的，其序列有A/B型兩種，即：106H·Met-Ala-Ile-Pro-Pro110-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp-Lys-Thr-Glu-Ile-Pro120-Thr-Ile-Asn-Thr-Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro130-Thr-Ser-Thr-Pro-Thr-Thr/Ile-Glu-Ala-Val-Glu140-Ser-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Glu-Asp/Ala-Ser-Pro150-Glu-Val-Ile-Glu-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn160-Thr-Val-Gln-Val-Thr-Ser-Thr-Ala-Val169·OH。其結構特點是富含支鏈氨基酸，幾乎不含有芳香族氨基酸如苯丙氨酸(Phe)，只含有一個甲硫氨酸(Met)，沒有二級結構，其在波長280nm處無吸收峰，很難用考馬斯亮藍染色法檢測，只在205～217nm處有吸收峰，因此，經常用210nm/280nm處的紫外(UV)吸收差來評價CGMP的純度。

牛的CGMP主要有A型和B型兩種[12]，它們的不同在于此多肽鏈的136位和148位的氨基酸不同，即A型的136位和148位氨基酸分別為蘇氨酸(Thr)和天冬氨酸(Asp)，而B型的為異亮氨酸(Ile)和丙氨酸(Ala)。CGMP中的131、133、135、136位和142位的蘇氨酸殘基為糖配體化的部位，127位和149位的絲氨酸(Ser)為磷酸化的部位[13-15]，都是實現其生理功能的重要位點。

在酪蛋白糖聚肽中，糖基基團主要有3種：Gal-半乳糖、N-乙酰神經氨酸(NeuNAc，也稱唾液酸)、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)，糖鏈主要是以O-糖苷型結合的2種中性和3種酸性糖鏈，90%以上的結合糖鏈都含唾液酸。已經被證實存在5種糖[16]：單糖：GalNAc-O-R(0.8%)；二糖：Galβ1→ 3GalNAc-O-R(6.3%)；三糖：NeuAcα2→ 3Galβ5→ 3GalNAc-O-R(18.4%)；三糖：Galβ1→ 3(NeuAα2→ 6)GalNAc-O-R(18.5%)；四糖：NeuAcα2→3Galβ1→3(NeuAcα2→6)GalNAc-O-R(56%)。

1.3 研究開發現狀

目前，生產CGMP的方法主要有以下兩種：一是從甜乳清中分離純化CGMP，二是用酶水解牛乳酪蛋白生產CGMP，其中以第一種方法較多。其分離方法主要涉及沉淀法、超濾法、色譜分離法以及綜合分離純化的方法。早期制備CGMP的方法主要是在酸性介質中分離熱處理變性后的乳清蛋白，再用乙醇選擇性沉淀。1988年，Morr等[17]利用三氯乙酸(TCA)沉淀法只能分離出含有糖配體的CGMP，并且CGMP的回收率只占乳清粉的6.7%[18]。Tolkach等[19]于2004年建立用谷氨酰胺轉氨酶(transglutaminase，TGase)交聯和膜分離技術相結合的方法分離乳清蛋白中的各種活性成分，得到了較好的效果。本實驗室李博智等[20]利用谷氨酰胺轉氨酶(TGase)結合微濾技術從乳清中分離純化CGMP。通過實驗得出最佳酶反應條件為乳清粉質量濃度8g/100mL，谷氨酰胺轉氨酶添加量7U/g、pH6.5、溫度39℃、反應時間80min，最后經微濾可得到純度為70%左右的CGMP。其分離方法步驟簡單、分離周期短、成本較低，易于擴大生產。但是由于所得的CGMP為交聯體，其生物學功能尚不明確，然而作為苯丙酮酸尿癥(phenylketonuria，PKU)病人的專用蛋白補劑將具有很好的開發前景。此外，本實驗室始終以努力提高原料乳的附加值和綜合利用水平為宗旨，利用不同技術手段成功地從乳中分離純化出CGMP，并建立起了相應的成熟工藝路線[20-21]，為實現CGMP以及相關生物活性產物的產業化打下了堅實的基礎。到目前為止，工業化生產CGMP主要考慮的因素包括生產價格、產品純度以及操作周期。日本一家公司同時采用先進的過濾技術以及離子交換技術，最早實現了CGMP的工業化，為CGMP廣泛的應用提供了可能。美國的威斯康星也產業化C G M P。國內尚無此產品的工業化生產。總之，對CGMP的制備以及實現產業化的技術還需深入地探討和研究。

2 IBD發病機理

2.1 免疫因素

2.1.1 免疫調節細胞

原始T細胞可分化為各種T細胞亞群，包括輔助性T細胞(Th細胞)、抑制性T細胞(Ts細胞)和調節性T細胞(Treg細胞)等。1986年，Mosmann等[22]首先將Th細胞分為Th1和Th2兩大類。Th1細胞以表達IL-12、IFN-γ、TNF-α為主，介導細胞免疫；Th2細胞以表達IL-4、IL-5、IL-10為主，介導體液免疫反應。Th1和Th2細胞之間相互作用調節著機體免疫平衡，維持機體內環境的相對穩定，研究報道顯示Th1/Th2亞群失衡可能是IBD的重要發病機制之一[23-24]。

Treg細胞是一類不同于Th1和Th2的T細胞亞群，依賴特異性轉錄因子Foxp3以維持穩定表達，并通過細胞－細胞間直接接觸和釋放IL-10、TGF-β等細胞因子而抑制自身反應性T細胞的增殖活化，維持自身免疫耐受[25]。根據表面標志物、分泌的細胞因子及作用機制的不同，可分為不同的亞型，目前對這類細胞研究較多的一類亞型是CD4＋CD25＋Treg細胞，可從人的胸腺和外周血中分離到。大量動物實驗表明，如果CD4＋CD25＋Treg細胞數量減少、功能異?；蛞种乒δ苁軗p，均可導致腸黏膜損傷，從而誘發IBD，然而，給予Treg細胞可治愈實驗動物腸道炎癥[26]。因此Treg細胞在IBD的發病和治療中起著重要作用。

Th17細胞是新近發現的CD4＋T細胞亞群，其主要分泌IL-17。近年對IBD遺傳背景的研究發現，Th17細胞產生的IL-17及影響Th17細胞分化的IL-23受體基因多態性與IBD的發病相關[27-28]，提示Th17細胞參與了IBD的發病過程。研究也表明T細胞各亞群之間是相互制約，且在一定條件下可相互轉化。IBD的免疫紊亂可能是多細胞亞群之間的失衡造成的。

2.1.2 細胞因子

細胞因子主要由活化的免疫細胞產生，在免疫應答過程中起著重要的調節作用。IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-23、TNF-α、IFN等屬于促炎細胞因子，主要由單核細胞以及巨噬細胞產生，參與細胞免疫反應。抗炎細胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等，主要由T細胞產生，參與體液免疫反應。促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間的平衡失調被視為IBD的重要發病機制，細胞因子失調可由Thl/Th2紊亂引起，并反饋性地加重Thl/Th2失衡，從而形成惡性循環。近期的研究還顯示，炎癥是生物體應對病原體和有害刺激時的復雜生物反應。半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)通過切割IL-1β、IL-18和IL-33的前體，參與了炎癥反應；Caspase-1的激活是自身嚴格調控的，并成為限制炎癥的又一個獨特機理，也就是說Caspase-1炎性體在自體炎癥疾病中發揮重要的作用[29]。

2.1.3 腸黏膜屏障

腸上皮細胞有Toll樣受體(TLR)、NOD1、NOD2受體以及特異性抗體的受體表達，上皮細胞特異性NF-κB激活或抑制成為IB D免疫應答激活或抑制的節點。NF-κB信號通路既能維持腸上皮正常黏膜內環境穩定，又可介導病原特異性應答，對黏膜屏障兼具保護和損害作用。散布于絨毛隱窩中的Paneth細胞、杯狀細胞等均能對抗微生物，并且有助于上皮細胞和腸黏膜的修復，減輕結腸炎癥損傷程度。提示腸上皮屏障損傷可能參與了IBD的發病過程。

2.2 微生物因素

腸道內存在著大量的微生物，這些共生菌群與人體健康息息相關。Mazmanian等[30]研究證明腸道菌群失調是造成免疫失衡，誘發IBD等腸道疾病的主要原因。動物實驗也顯示，特發性慢性結腸炎可能完全是由腸道菌群失調所致，大多數動物在無菌環境中不發生結腸炎，但在腸道菌群內環境發生改變時迅速發生結腸炎[31]。正常腸道共生菌群及其產物可能作為自身抗原而誘導免疫耐受，腸道感染時，一些條件致病菌損害腸黏膜屏障，腸腔內細菌及其產物等抗原移位至腸黏膜固有層并激活黏膜免疫系統，使之對腸腔內抗原失去耐受，從而誘發IBD。臨床觀察顯示微生物所致的腸道感染能使緩解期IBD復發[32]。

3 乳源CGMP對IBD的改善作用

近年來，本實驗室在連續獲得兩項國家自然科學基金的資助下，系統地從CGMP對腸道免疫調控系統、腸道菌群變化以及和腸道炎癥反應的相關性等方面進行了研究。

3.1 乳源CGMP對IBD的免疫調節作用研究

賈玉臣等[33]以UC動物模型為對象，初步研究了CGMP對惡唑酮(oxazolone，OXZ)誘導小鼠結腸炎的治療效果，從CGMP對模型小鼠的體質量、結腸炎的3項氧化損傷指標(二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、髓過氧化物酶(my e lo p ero x id a s e，M PO)及丙二醛(malondialdehyde，MDA))、大體形態損傷評分以及病理組織形態的影響這四個方面進行了探討。實驗結果表明，OXZ誘導的小鼠結腸炎模型對照組的氧化損傷指標DAO活力、MPO活力以及MDA含量均比正常小鼠組顯著升高，由此可知潰瘍性結腸炎小鼠的結腸組織具有明顯的氧化損傷；通過灌胃不同劑量的CGMP，結果顯示低劑量的CGMP使潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中的MPO活力顯著降低，中劑量的CGMP使潰瘍性結腸炎小鼠DAO活力、MPO活力及MDA含量顯著降低，高劑量CGMP使潰瘍性結腸炎小鼠DAO活力和MPO活力顯著降低，因此，CGMP可能通過發揮抗炎活性抑制腸道炎癥反應，從而使潰瘍性結腸炎的病征得到緩解。此外研究結果還證實了CGMP能夠保持較完整的上皮細胞，維持結腸組織形態的完整。灌胃低、中、高劑量的CGMP一段時間后，可有效改善OXZ誘導的小鼠結腸炎，其中以中劑量CGMP的作用較為顯著。因此CGMP可作為一種營養方案使小鼠的潰瘍性結腸炎在一定程度上得到治療。

Daddaoua等[34]以IBD動物模型為對象，研究了CGMP對三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導大鼠結腸炎的治療效果，從CGMP對模型大鼠的體質量、大體形態損傷評分以及與炎癥相關的因子(如AP、iNOS、IL-1β、TFF3等)在結腸炎中的表達水平等方面研究CGMP在腸道中的抗炎作用，并且進一步比較了CGMP與治療IBD的藥物柳氮磺胺吡啶的抗炎效果。研究證實灌胃合適劑量的CGMP可以有效地降低結腸炎大鼠的形態損傷、AP的活性和iNOS等炎癥因子的表達，其抗炎效果與柳氮磺胺吡啶相同。Requena等[35]也以IBD動物模型為對象，研究了CGMP對TNBS誘導大鼠回腸炎的治療效果，研究證實灌胃合適劑量的CGMP可顯著降低回腸炎大鼠的形態損傷、MPO活力、iNOS和COX-2的表達，其抗炎效果與治療IBD的藥物5-對氨基水楊酸相同。該研究還發現Th17和Treg細胞在CGMP的抗炎作用中起著重要作用，與TNBS模型對照組相比，灌胃合適劑量的CGMP可顯著降低回腸炎大鼠Treg細胞的表面標記Foxp3的表達和Th17表達的IL-17 mRNA水平，由此可知CGMP可能通過調節Treg細胞的數量和功能以及下調IL-17發揮抗炎作用來改善和緩解回腸炎的病癥。

目前IBD的發病機制已從細胞因子、轉錄因子、腸道菌群等方面得以闡釋，炎癥細胞因子和抗炎細胞因子之間的平衡將成為治療IBD的重要靶點。賈玉臣等[36]研究了CGMP對健康小鼠IFN-γ和IL-4的調節作用，探討CGMP可能通過調節Th1/Th2的失衡從而發揮在腸道內的抗炎作用，使IBD的病癥得以緩解。研究顯示灌胃小鼠CGMP 12h內IL-4會出現明顯的增高趨勢，而在實驗期間IFN-γ并未呈現明顯的變化趨勢；在連續5d灌胃CGMP的實驗期間，CGMP組小鼠在灌胃后第2天至第5天腸黏膜的IL-4質量濃度明顯高于對照組和空白對照組，而IFN-γ在實驗期間也未表現出明顯的變化趨勢，從而使得在連續灌胃后的第2天至第5天CGMP組的IFN-γ/IL-4比值較空白對照組與生理鹽水組均低，提示CGMP可能具有下調Th1/Th2的潛在功效，但是CGMP對IFN-γ的影響是不顯著的，該結論與Requena等[37]近期的研究成果是一致的。CGMP可促進抗炎細胞因子IL-4表達的結論為進一步研究CGMP在腸道內的抗炎機制提供了佐證，同時也表明調控Th1和Th2平衡對解決相關炎癥性疾病具有重要作用。Requena等[38]還研究發現了CGMP可以通過激活NF-κB和MAPK信號轉導途徑而誘導細胞因子的產生。眾多資料顯示UC和CD患者腸黏膜組織活檢中NF-κB p65亞單位表達明顯上調，在IBD復雜的細胞因子網絡失調中，NF-κB活化可能是一中心環節，因此CGMP介導NF-κB和MAPK等信號轉導途徑的激活是其發揮抗炎作用、調理和治療IBD可能的作用機制。本實驗室最近也完成了乳源CGMP改善小鼠潰瘍性結腸炎機制的研究，以灌胃CGMP劑量為50mg/(kg·d)，連續灌胃5d為基礎，利用流式微珠陣列技術(cytometric bead array，CBA)和酶聯免疫技術(ELISA)檢測各組小鼠血清中細胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF-α和IL-10的濃度，并利用Western Bloting技術檢測各組小鼠結腸組織蛋白中MAPK p38和NF-κB p65表達的差異，從細胞因子和免疫信號通路的角度探討CGMP發揮抗炎活性的機制。研究證實CGMP通過抑制潰瘍性結腸炎小鼠體內NF-κB和MAPK的激活，有效抑制UC小鼠體內IL-1β、IL-5、IFN-γ和TNF-α的升高，同時促進IL-10的分泌，從而減緩炎癥程度。

3.2 乳源CGMP維持腸道微生物菌群作用的研究

大量研究和臨床觀察發現腸道菌群失調和內環境的改變和腸道持續感染會引起IBD的發生和復發。曹晉宜等[5]研究了CGMP對小鼠腸道菌群消長規律的影響，研究證實CGMP不同灌胃劑量對小鼠腸道微生物區系中各菌群的影響存在顯著的促進和調控優勢菌群生長的特性，對構建膜菌群具有顯著的作用。其中中劑量組(80μg/d和100μ/d)可以有效促進雙歧桿菌和乳酸桿菌增殖，同時能夠有效降低腸桿菌、腸球菌，特別是致病菌的繁殖，有效降低了腸道中致病菌和條件致病菌的數量，可以調整機體的微生態平衡，增強機體的免疫力。由此可知灌胃適當劑量的CGMP后腸道中益生菌得到顯著的增殖，條件致病菌和致病菌的增殖得到有效抑制，這就可以有效地防止細菌易位現象的發生，實現了對腸道占位性保護作用。提示我們CGMP可能通過維持腸道微生態的平衡，糾正菌群失調，從而具有可以改善和調理IBD的作用。2010年曹晉宜等[39]報道了基于ERICPCR技術研究CGMP對小鼠腸道菌群結構的影響，其目的是了解CGMP對小鼠腸道中微生物群落結構及其動態變化的影響。研究結果證實了小鼠腸道內的微生物群落非常豐富，普遍存在共有的優勢菌群，且優勢菌群的群落結構較為穩定；CGMP能夠顯著增加小鼠腸道菌群的多樣性；聚類分析結果顯示：對照組小鼠個體在不同時間的腸道菌群結構相似性較高，對照組小鼠腸道菌群多樣性指數范圍為1.75±0.06，CGMP組多樣性指數范圍為1.89±0.04，二者之間差異有統計學意義。研究表明采用ERIC-PCR技術分析鑒定在灌胃小鼠CGMP期間其ERIC-PCR指紋圖譜沒有明顯的規律；CGMP組小鼠個體的ERIC-PCR指紋圖譜被明顯地分成兩個亞族，說明小鼠灌胃CGMP 3～5d后，其腸道菌群的群落結構開始發生明顯變化。

4 結 語

綜上所述，IBD的發病機理以及開發一種有效的治療方案一直是該領域的研究熱點。本實驗室和國外的最新研究可以證實CGMP具有抗炎活性，在一定程度上可以改善、緩解和治愈IBD。同時，CGMP是一種乳源的生物活性肽，具有廣泛的生物學功能，決定了其潛在的商業價值和開發的可行性。因此CGMP可以作為功能性食品用于炎癥性腸病的生物免疫治療，為解決IBD等常見、難愈疾病提供了一條新的、有效的途徑。但CGMP的科學明確的抗炎活性機制還有待于后續從分子水平上研究解決，圍繞其對一些免疫分子和免疫信號途徑的影響將有助于進一步闡明治療IBD的機制。

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Research Progress in Bovine Casein Glycomacropeptide for the Improvement of Inflammatory Bowel Disease

ZHU Chen-chen，CHEN Qing-sen*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Casein glycomacropeptide (CGMP) is mainly a class of peptides bearing carbohydrate chains derived from the hydrolysis ofκ-casein by tenet. Because CGMP has many physiological functions and unique nutritional properties, it can be widely used in the fields of functional food and medicine. CGMP has been reported to have anti-inflammatory activity such as improvement and immunotherapy on inflammatory bowel disease (IBD). In this paper, the sources, structural characteristics and current research status of CGMP are outlined. Recent research advances in the regulatory, improving and therapeutic effects of CGMP on IBD are reviewed. Moreover, the future development prospects of CGMP are also proposed.

casein glycomacropeptide (CGMP)；inflammatory bowel disease (IBD)；immunoregulation; intestinal flora

TS201.2

A

1002-6630(2012)01-0262-05

2011-07-20

國家自然科學基金項目(31071522)

朱晨晨(1988—)，女，碩士研究生，研究方向為生物活性肽與健康。E-mail：zcckathy@126.com

*通信作者：陳慶森(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為發酵生物技術、蛋白資源開發與應用。E-mail：chenqs1689@163.com