人miR-205真核表達載體的構建及鑒定

吳義高，肖 戈，徐文清，黃 福，胡衛列，王 尉

(1南方醫科大學研究生學院，廣州510515;2廣州軍區廣州總醫院泌尿外科研究所)

國內外研究發現，miR-205參與了細胞的增殖、分化、凋亡及侵襲等，與惡性腫瘤發生、發展密切相關［1］。我們前期研究發現在腎上腺皮質癌(ACC)中miR-205低表達。但miR-205在ACC中的作用機制尚不清楚，且目前國內外鮮見miR-205與ACC關系的報道。ACC惡性程度高，侵襲性強，約40%在診斷時已出現遠處轉移，其早期診斷與腎上腺良性腫瘤鑒別困難，其治療仍以根治手術為主，缺乏有效的藥物治療，術后復發率高，預后差［2］。2011年9月～2012年5月我們通過構建miR-205真核表達載體，轉染SW-13細胞后使其獲得miR-205的穩定高表達，從而為miR-205靶點驗證和功能研究提供強有力的實驗基礎，為ACC臨床診療提供一種可能的新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 ACC細胞SW-13購自上海細胞所; pcDNA3.1(+)為南方醫科大學腫瘤研究所保存; E.coli DH5α感受態細胞、Lipofectamine 2000 Reagent購自Invitrogen公司;G418、LATaq聚合酶、T4 DNA Ligase、dNTPMixture、HindⅢ、XhoⅠ限制性內切酶、DNA marker、膠回收試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix均為TaKaRa公司產品;基因組DNA提取試劑盒、質粒抽提試劑盒、無內毒素質粒提取試劑盒為Promega公司產品;IL-15培養基及胎牛血清均由廣州威佳公司提供。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設計與合成 miRbase數據庫中獲得miR-205前體pre-miR-205的序列(AAAGATCCTCAGACAATCCATGTGCTTCTCTTGTCCTTCATTCC ACCGGAGTCTGTCTCATACCCAACCAGATTTCAGTG GAGTGAAGTTCAGGAGGCATGGAGCTGACA)，在premiR-205的頸環序列上下游各延伸200 bp左右設計引物調取pre-miR-205基因組序列，并在引物上引入末端的保護堿基、HindⅢ、XhoⅠ的酶切位點，引物由上海生工生物公司合成。引物序列為:miR-205 HindⅢ F:5'-CCC AAGCTTCTGGGTGGCTGTTTTGAAAAC-3';miR-205 XhoⅠR:5'-CCGCTCGAGGA AGCACGCACACTCCAGATG-3'。

1.2.2 miR-205真核表達載體pcDNA3.1(+)-miR-205的構建與鑒定 按DNA抽提試劑盒說明書提取腎上腺皮質細胞SW-13基因組DNA，用預先設計引物進行PCR擴增，反應條件為94℃5 min預變性，94℃ 20 s，55℃20 s，72℃ 35 s經過30個循環，再72℃擴增5 min后于16℃保存;PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用DNA凝膠回收試劑盒回收獲得目的產物。將回收的目的產物用HindⅢ、XhoⅠ限制性內切酶酶切，獲得目的基因片段。pcDNA3.1(+)質粒經HindⅢ、XhoⅠ雙酶切后回收線性化空載體。取2 μL回收的線性化空載體與3 μL的目的基因片段，在T4 DNA Ligase作用下，16℃連接2 h;連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞后，均勻涂于含氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，37℃過夜培養。使用質粒提取純化試劑盒進行質粒提取，取3 mL提取質粒在37℃下HindⅢ、XhoⅠ酶切2 h，酶切產物在含1%瓊脂糖凝膠電泳分離，UVP凝膠成像系統成像;最后將酶切鑒定正確的克隆送華大基因公司測序，無內毒素質粒提取試劑盒抽提測序正確克隆的質粒，－20℃冰箱中保存備用。

1.2.3 SW-13細胞轉染pcDNA3.1(+)-miR-205和穩定克隆的篩選 轉染前1 d對SW-13細胞株進行傳代，使其匯合度為60%～70%，轉染采用Lipofectamine 2000試劑，轉染時使用Opti-MEM培養基。實驗共分3組:①pcDNA3.1(+)空載體組;②pcDNA3.1(+)-miR-205重組質粒組;③未轉染組。每組設3個復孔。轉染使用24孔板，每孔加入1 μg質粒，稀釋到400 μL Opti-MEM培養基為A液，取2 μL Lipofectamine 2000溶解于100 μL Opti-MEM培養基為B液，B液混合5 min后，A液和B液混合，靜止20 min后加到細胞培養板中，以上操作是每孔用量。孵育4 h后換為10%FBS的IL-15完全培養基。轉染24 h后，換為含G418(200 mg/L)的10% FBS的IL-15完全培養基，每3 d換1次液，2周后未轉染組SW-13細胞全部死亡，轉染組仍有細胞存活，繼續按上述方法壓力篩3周后，獲得穩定細胞系，擴大培養。

1.2.4 RT-qPCR驗證SW-13細胞轉染pcDNA3.1 (+)-miR-205的表達情況 轉染pcDNA3.1(+)-miR-205細胞組、轉染pcDNA3.1(+)細胞組及未轉染組分別進行培養，提取總RNA，純度檢測:OD260/ OD280的比值大于1.8，在反轉錄酶作用下反轉錄形成得第一鏈cDNA為模板，由實時定量熒光miRNA特異引物進行 PCR反應，使用 SYBR Green PCR Master Mix，反應條件:95℃變性15 s，65℃退火15 s，72℃熒光檢測32 s，重復40個循環。60～95℃繪制溶解曲線，每個樣品重復3次。PCR反應以U6為內參照，其引物為:U6-F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，U6-R:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'; miR-205引物序列為:pre-miR-205 F:5'-ACACTCCAGCTGGGTCCTTCATTCCACCGGAG-3'，pre-miR-205 R:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。

2 結果

2.1 PCR擴增基因組DNA中miR-205片段 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后在553 bp處可見一特異擴增條帶，擴增條帶在Marker 500 bp和750 bp之間，產物的大小與NCBI數據庫檢索的miR-205大小一致，證明miR-205目的基因已擴增出來(封二圖3)。

2.2 重組質粒pcDNA3.1(+)-miR-205的雙酶切鑒定 重組質粒pcDNA3.1(+)-miR-205經HindⅢ、XhoⅠ雙酶切后，可見一大一小兩條擴增帶，其中在553 bp的位置出現目的條帶(封二圖4)，說明篩到的克隆為陽性克隆，送質粒去測序。

2.3 重組質粒pcDNA3.1(+)-miR-205的測序鑒定重組質粒pcDNA3.1(+)-miR-205經酶切分析為正確的克隆，基因測序生物公司的測序結果與miRbase中的序列一致。Sequence 0、Sequence 1分別為pre-miR-205、pcDNA3.1(+)-miR-205序列，經Megalign比對軟件證實了構建的重組質粒正確(封二圖5)。

2.4 RT-qPCR檢測miR-205的表達差異 pcDNA3.1(+)轉染組與未轉染組相比，兩者miR-205的表達無明顯差異，而pcDNA3.1(+)-miR-205轉染組與 pcDNA3.1(+)轉染組相比，pcDNA3.1 (+)-miR-205轉染組miR-205的表達升高約32倍(P＜0.01)，表明重組表達載體 pcDNA3.1(+)-miR-205能夠在SW-13細胞中高水平表達miR-205。

3 討論

在不同種屬中，miR-205都是一種高度保守的miRNA。在保護小鼠及紅鰭東水鲀基因序列的基礎上，miR-205通過計算機方法首次被預測出來［3］，隨后miR-205的表達在斑馬魚及人類體內得到確認［4，5］。miR-205基因定位于 1號染色體 LOC 642587位點第二內含子上。miR-205在斑馬魚上皮表達［6］，在人類乳腺癌、腎癌、膀胱癌等多種腫瘤細胞中明顯低表達［7］。

研究miRNA功能較為直接的是利用遺傳學方法。早先的miRNA及功能都是通過正向遺傳學方法鑒定的，即利用突變表形尋找遺傳位點，再克隆基因［8］。反向遺傳學則是通過從已知miRNA出發，通過異常表達產生的表型，從而獲知miRNA功能。利用反向遺傳學方法，人們發現miR-181促進骨髓造血肝細胞B細胞分化［9］，miR-375調控胰島素分泌［10］。反向遺傳學的核心是過表達技術，構建miRNA真核表達載體是一種較常用過表達技術，其miRNA能發揮更持久的作用。構建miRNA真核表達載體的方法有:①利用統一表達框的miRNA過表達技術［11］;②利用人類基因組DNA為模板，擴增出miRNA的前體序列后克隆到真核表達載體［12］，構建成能夠過表達miRNA的真核重組載體。構建miRNA的真核表達載體能較好地模擬體內miRNA的自然表達過程，能夠更真實地體現miRNA的生物學功能。

本研究我們采用的真核表達載體pcDNA3.1 (+)，該載體含CMV啟動子，Amp、Neo抗性基因及polyA加尾信號等，并且能夠在大多數哺乳動物細胞中穩定表達［13］。我們將重組質粒 pcDNA3.1 (+)-miR-205轉染到SW-13細胞，細胞培養過程中始終維持G418篩選壓力，獲得質粒整合進基因組DNA的單克隆細胞。為了檢測重組質粒pcDNA3.1 (+)-miR-205在篩選獲得的SW-13細胞中是否能夠穩定表達miR-205，我們通過RT-qPCR技術進行檢測，結果顯示miR-205在SW-13細胞內較高水平表達，說明重組質粒載體pcDNA3.1(+)-miR-205在SW-13細胞系中篩選成功。這為進一步研究miR-205在腫瘤細胞的生長、凋亡、侵襲浸潤所起的作用提供研究基礎，為ACC的診療提供一種可能的新的方法。

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