牛結核病診斷方法研究

夏輝 盧國偉 付剛 （山東省臨朐縣畜牧局 262600)

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牛結核病診斷方法研究

夏輝 盧國偉 付剛 （山東省臨朐縣畜牧局 262600)

牛結核病主要是由牛分支桿菌引起的一種人畜共患傳染病，近年來該病發病率有所上升，給奶牛養殖業造成了巨大的危害。目前，牛結核病的診斷仍然以傳統的遲發性變態反應試驗為主，其他診斷方法有根據臨床癥狀和病理變化診斷、抗酸染色法、PCR 法、血清學等方法。為了凈化該病，必須提高診斷方法的敏感性和特異性。為了探索基層獸醫機構對該病的診斷方法的應用，文章對這些診斷方法及其優缺點做了分析，并指出結核病基層普查檢測時，比較合理經濟的診斷方式是遲發性變態反應試驗和間接ELISA法同時運用。

1 牛結核病的基本情況

結核病是由分支桿菌屬的結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分支桿菌(M.bovis)和禽分支桿菌(M. avi um)引起的一種嚴重的人畜共患慢性消耗性傳染病。除感染人外，能引起多種哺乳動物和禽類發病。結核分支桿菌、牛分支桿菌和禽分支桿菌，分別主要引起人結核、牛結核和禽結核。牛結核和人結核可以相互感染，禽結核也可以感染牛和人類。牛結核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分支桿菌引起，能在多種組織器官形成干酪樣壞死、肉芽腫(結核結節)和鈣化結節病變為特征。在家畜中，牛最易感染結核病，特別是奶牛，其次是水牛和黃牛。世界動物衛生組織(OIE)將牛結核病列為B類動物疫病。

20世紀50年代我國出現了牛結核病的大暴發，如1955年檢出陽性率達36.4%，以后由于采取了有效措施及長期努力，使結核病陽性率大大降低并控制在較低水平。1985年和1987年兩次全國奶牛抽樣調查結果顯示，牛結核病的患病率分別為5.83%和5.43%。但近年來，隨著個體奶牛養殖戶的增加，結核病的陽性檢出率在逐年上升。尤其是2003年廣州市某大型奶牛公司下屬奶牛場630頭奶牛有70%患結核病的情況下，每日仍有2t多病牛奶供應廣州市場。目前我國一些省區牛結核病的發病率呈現上升趨勢，已達到9%甚至更高的陽性檢出率。因此，做好牛結核病的定期檢測普查工作相當重要。筆者所在的臨朐縣是奶牛養殖大縣，在基層獸醫站利用合理經濟的診斷方式診斷牛結核病對當地奶牛產業的發展作用更加明顯。

2 臨床癥狀和病理變化

牛結核病臨床癥狀不典型，感染前期不出現臨床癥狀，而感染后期常出現體弱、厭食、消瘦、呼吸困難、淋巴結腫大和咳嗽等，這些癥狀在其它疾病中也可見到，因此不具有典型性，故早期臨床診斷不易獲得準確結果。病理學檢查可以根據特征病變確診，如干酪樣壞死、鈣化、上皮樣細胞、多核巨細胞和吞噬細胞等，但必須在宰殺后才能進行。

3 牛結核病的診斷方法

3.1 抗酸染色法 病料涂片后進行抗酸染色，顯微鏡檢查抗酸性桿菌，本菌的細胞壁不僅有肽聚糖，還有特殊的糖脂，因為糖脂的影響，致使革蘭氏染色不易著染，但能抵抗30ml/L酸酒精的脫色作用，抗酸染色為紅色，常用齊尼二氏(Ziehl2Neel son)染色法，也可用熒光抗酸染色法。如果組織內有抗酸性微生物，并且具有典型的組織學病變，則可以做出初步診斷?？顾崛旧栃月时容^低，但它作為一種傳統的檢測方法，具有假陽性率低，價格低廉，操作簡便等特點，在牛場中就可進行，所以仍有一定的實用價值。

3.2 PCR法 PCR技術自1983年發明以來，顯示出了靈敏度高、特異性強、快速等特點，已經被廣泛地用于檢測疑似結核病病人的臨床樣品(主要是痰液)，近年來在檢測牛結核病方面也有應用。Ritelli M等道，將人的一個巨噬細胞系用來從臨床樣品中分離擴增分支桿菌，收集培養后的細胞，再通過半套式PCR檢測培養物中牛分支桿菌的特異性插入序列IS6110，可以確定有沒有牛分支桿菌感染。劉思國等根據已經發表的牛分支桿菌的pncA基因序列，設計引物可擴增294bp目的片段，建立了特異性檢測牛分支桿菌的PCR方法，該方法特異性強，敏感度可達到50pg，陽性樣品符合率為90%，陰性樣品符合率為100%而且有利于結果的判定和臨床樣品的直接檢測。但是，商品化試劑盒和各科研部門研制的方法檢測結果差異較大。含有少量細菌的樣品降低了檢測結果的可靠性。由于去除污染的方法、DNA提取步驟、去除酶抑制劑技術、內部和外部控制以及交叉污染的防止措施等差異使得結果千差萬別。該方法還需要標準化和更加嚴格的操作步驟，以克服實驗過程中容易出現的假陽性或假陰性問題。

3.3 遲發性變態反應試驗 目前臨床上應用最廣泛的是遲發性變態反應(delayed type hypersensitivity，DTH)試驗，即結核菌素試驗(tuberculin test)，它是測定牛結核病的標準方法，也是國際貿易的指定方法。對牛皮內注射結核菌素，并在72h后測量注射部位腫脹程度。美國就是采用撲殺結核菌素試驗陽性牛而消滅了牛結核病。它的技術要求不高，但是工作量大，檢出時間長，操作麻煩，許多因素都可以降低該方法的敏感性和特異性。由于提純結核菌素(PPD)皮膚試驗個體差異較大，注射劑量和PPD批號對牛個體反應均有差異，會呈現不同的皮膚反應，其結果以皮膚厚度的增加數為準，易造成人為誤差。結核菌素試驗陽性僅能表明在過去某一時間曾經發生過的一次結核菌感染，它無法證明目前的結核菌感染是否為活動的，或僅為在機體的某處有活的結核菌存在。當動物發生某些細菌或病毒的感染時，或者使用某些藥物治療及一些不明原因，也可能造成假陽性或假陰性結果。部分研究者還發現，該法存在著極強的非特異性，即在相當數量的結核菌素試驗陽性牛中，既找不出特征病變，又不能分離出結核菌，或僅僅分離出非典型的分支桿菌，重復檢疫時陽性率下降，而且妊娠母牛檢出率低，給基層的撲殺工作帶來困難，因此在實際工作中，用于診斷牛結核病并不十分理想。

3.4 ELISA法 細胞免疫隨病情加重而減弱，體液免疫隨病情加重而增強。結核菌是典型的胞內寄生菌，尤其是在巨噬細胞內。對結核菌的免疫，首先是細胞免疫，其次才是體液免疫，二者是分離的。所以反映細胞免疫強弱的遲發性變態反應，不能檢出所有的結核病牛，僅以此法檢測牛結核病顯然是不準確的。研究認為，結核病牛血清抗體IgG與正常水平差異顯著，從理論上闡明了檢出血清中抗體以診斷疾病的可能性。結核菌的IgG抗體的血清水平與病變程度呈正相關，因此檢測血清中IgG 抗體的水平對于疾病的診斷有重要意義。細胞免疫是主要的免疫方式，PPD是檢測細胞免疫，血清學方法是檢測體液免疫，所以PPD的檢出率要高于血清學方法。但是，PPD陽性不能全部包括所有抗體陽性，且PPD陽性牛，也未必有臨床表現，而抗體陽性往往意味著病情正在惡化，正是危險的傳染源，所以從這方面來看，血清學方法比PPD檢測更重要。另外，非典型分支桿菌感染及某些寄生蟲病等非特異性因素的干擾，均可引起牛的遲發性變態反應陽性，而體液免疫的水平卻很低，這樣就使得血清學方法更容易排除假陽性。但牛分支桿菌與其他許多分支桿菌具有類屬的抗原性，因此常出現假陽性反應而干擾牛結核抗體的檢測。高云航等以草分支桿菌作為吸收抗原處理待檢血清，吸收其中的非特異性類屬抗體，提高了牛結核EL ISA的特異性。

4 結語

牛結核病的診斷方法有很多，任何檢測方法都有其優點和缺點，如與細胞免疫相應的淋巴細胞增生試驗和γ－干擾素試驗或者因為操作繁瑣，或者因為成本高，所用試劑含有放射性物質，難以在基層牛結核病的常規檢測中運用；分子生物學檢測技術需要貴重的儀器設備，技術復雜，對實驗室和操作人員的要求較高等原因，使其在基層常規牛結核病普查中難以運用；目前作為法定檢疫方法，結核菌素試驗仍然是普查檢疫中運用的方法，但它有許多不足之處。所以，牛結核病普查中比較好的做法是，檢測細胞免疫的結核菌素試驗和檢測血清抗體的間接ELISA同時運用，互相彌補不足之處，盡可能的提高檢測的敏感性和特異性。在凈化牛場時，ELISA檢測為陽性的病牛，不管結核菌素試驗是否為陽性，都應該進行撲殺處理。結核菌素試驗陽性而ELISA檢測陰性的牛，應該重復進行結核菌素試驗，再結合其他的檢測方法，排除非特異性因素的干擾，以降低經濟損失。

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（2012–04–18）

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