空腸彎曲桿菌的分離鑒定

馬艷輝 （山東省諸城市畜牧獸醫管理局 262200）

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空腸彎曲桿菌的分離鑒定

馬艷輝 （山東省諸城市畜牧獸醫管理局 262200）

空腸彎曲桿菌是一種人畜共患病致病菌，作為一種食物源性病原菌，空腸彎曲桿菌能引起人和動物發生多種疾病，其治病機理正在被廣泛的研究，本文主要介紹了目前空腸彎曲桿菌相關疾病的研究進展，以及通過實驗介紹空腸彎曲桿菌的實驗室分離及鑒定的一般方法。

1 相關疾病的情況

1.1 原發性疾病

1.1.1 感染性胃腸炎 空腸彎曲桿菌通過糞，口途徑傳播，能感染人或動物引起急性胃炎，屬人獸共患性疾病，主要癥狀為腹瀉等。空腸彎曲桿菌的黏附、定居、毒素(腸毒素、內毒素、細胞膨脹毒素)及侵襲力為其主要發病機制。食物源性疾病包括中毒性疾病及感染性疾病，因攝入被污染的水或食物而導致致病物進入機體而發病。傳染源常為家禽、肉類、鮮奶。國外研究表明有23.1%~98%零售的雞肉受空腸彎曲桿菌污染，12%的鮮奶受污染。發達國家加工和消費禽肉為主要感染途徑。飲用受空腸彎曲桿菌污染的水、未消毒牛奶及與感染動物接觸發病。發病常以散發或暴發出現并呈現季節性。

1.1.2 感染性腸外疾病 空腸彎曲桿菌通過其他途徑感染可引起多種腸外疾病。孕婦及妊娠期動物感染易導致自然流產、死產、早產。此外，空腸彎曲桿菌感染性腸炎可并發腎小球性腎炎和腎小管間質性腎炎，并在患者糞便和腎活組織檢查中分離出空腸彎曲桿菌。空腸彎曲桿菌還與膿毒性關節炎、骨髓炎、眼葡萄膜炎及感染性腦膜炎等疾病有關。

1.2 并發癥

急性遲緩性癱瘓性疾病的腦脊液檢查有典型的白蛋白-細胞分離現象。急性感染性脫髓鞘性多發性神經根神經病、急性運動神經軸突性神經病、急性感覺神經軸突性神經病、急性運動-感覺神經性神經病以及Miller.Fisher綜合征(MFS)，并把這類癱瘓性疾病命名為GBS。主要臨床癥狀為起病急、肌無力，始于下肢，上肢或四肢同時發生，可持續數日或數周。感覺障礙，癥狀多于4周內達高峰。呼吸肌可受累，部分患者發生上瞼下垂或眼外肌麻痹。體格檢查可見明顯肢體近端或遠端無力，腱反射減低或消失。

綜上所述，空腸彎曲桿菌相關疾病繁多，傳播途徑及發病形式多樣，盡管有自限性，發病率、接觸率高，并發癥嚴重且預后差，近年來常以食物源性疾病發病，尤其是免疫力低下者包括獲得性免疫缺陷綜合征、血液病及接受化療等患者易并發嚴重腹瀉，且耐藥菌株增加引起局部暴發。目前其發病機制不完全明了，尚無有效的疫苗進行預防，因此，研究有效疫苗將成為預防其感染的最好策略。

2 空腸彎曲桿菌的分離鑒定試驗

2.1 材料與方法

2.1.1 培養基 Cary-Blair氏運送培養基、改良Skirrow氏瓊脂培養基、空腸彎曲菌瓊脂基礎培養基及空腸彎曲菌瓊脂配套試劑、布氏肉湯。

2.1.2 主要試劑 新鮮綿羊血；新生牛血清；DNA 聚合酶(5U/μl)、dNTPs。

2.1.3 培養基的制備 Cary-Blair氏運送培養基：42g培養基溶于1000ml水中，121℃高壓蒸氣滅菌15min，冷卻至適當溫度，無菌分裝至5ml EP管中，4℃保存備用。改良Skirrow氏瓊脂培養基：43g培養基溶于1000ml水中，121℃高壓蒸氣滅菌15min，冷卻到50℃左右時加入7%凍融綿羊血，1%空腸彎曲菌瓊脂配套試劑，無菌倒平皿，4℃保存備用。空腸彎曲菌瓊脂基礎培養基：42g培養基溶于1000ml水中，121℃高壓蒸氣滅菌15min，冷卻到50℃左右時加入5%新生牛血清，無菌倒平皿，4℃保存備用。

2.1.4 細菌的分離培養 無菌采集待宰牛肛門拭子于滅菌Cary-Blair氏運送培養基，于4℃帶回實驗室，劃線接種于改良Skirrow氏瓊脂培養基，置于42.0℃、10%CO2培養箱培養48h，挑取疑似菌落，染色鏡檢，并進行純培養。于-80℃冰箱保存。

2.1.5 細菌的鑒定 （1）PCR鑒定。用酚氯仿方法提取細菌的基因組DNA，調整DNA濃度為100ng/μL，作為PCR模板。基因設計的引物(上游引物P1：5'-AGCTAGCT TCGCATAATAACTTG-3'和下游引物P2：5'-GAAGAGGG TTTGGGTGGTG-3')，進行PCR擴增，擴增片段理論長度為750bp(空腸亞種)和500bp(德萊亞種)。反應體系25μl (10×PCR buffer2.5μl，2.5mmol/LdNTP2μl，25mmol/LMg CL22μl，10pmol/μl P1、P2各1uL，5U/μl酶0.2μl，DNA模板2μl，滅菌去離子水補足25.0μl)；反應條件為：95℃預變性5min；94℃1min、57℃1min、72℃1min，共進行30個循環；72℃10min，16℃結束反應，同時設參考菌株陽性、無模板對照。PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.2 結果

菌落特征與細菌形態在加有7%凍融綿羊血和1%空腸彎曲菌瓊脂配套試劑的改良Skirrow平板經42.0℃、10%CO2培養箱培養48h后長出透明、凸起、邊緣整齊、直徑1~2mm的菌落形態，經空腸彎曲菌瓊脂基礎培養基純化培養48h后，呈無色透明、白色或棕黃色或淺紅色、圓形、光滑濕潤、直徑1~2mm的菌落形態，染色鏡檢為螺旋形、彎曲桿狀或似飛翔的海鷗形的革蘭氏陰性細菌。

（2012–02–27）

S852.61+2

B

1007-1733(2012)07-0044-02