犬瘟熱及其診斷技術

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犬瘟熱及其診斷技術

黃二平（浙江省金華市金東區畜牧獸醫局 321031） 方遠書（浙江省金華市食品藥品檢驗所）

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒引起的犬的一種高度接觸性、致死性傳染病。早期雙相體溫熱型，癥狀類似感冒，隨后以支氣管炎、卡他性肺炎、胃腸炎為特征。病后期可見有神經癥狀出現如痙攣、抽搐。部分病例可出現鼻部和角墊高度角化。

本病一年四季均可發生，但以冬春多發。本病有一定的周期性，每三年一次大流行。不同年齡、性別和品種的犬均可感染，但以未成年的幼犬最為易感。純種犬、警犬比土種犬易感性高，而且病情反應重，死亡率也高。本病最重要的傳染源是鼻、眼分泌物和尿液。感染犬瘟病毒的犬60-90d后，尿液中仍有病毒排出，所以說尿液是很危險的傳染源，主要傳播途徑是病犬與健康犬直接接觸，也可通過空氣飛沫經呼吸道感染。

1 犬瘟熱的概述

1.1 臨床診斷

臨床診斷主要通過本病的流行特點、發病機理、臨床特征及類癥病的鑒別。

1.1.1 流行特點 在自然條件下可感染多種犬科野生食肉獸，如小熊貓、貉、貂、黃鼠狼，以及豺、狼、獾等。本病一年四季都可發生，冬春季多發。6月齡以內的幼犬特別易感染，癥狀典型，死亡率極高。世界各地都有流行。

1.1.2 發病機理 感染后病毒主要從鼻咽和呼吸道散布到支氣管淋巴結和扁桃體進行原發性增殖，引起病毒血癥，病毒分布到全身淋巴器官、骨髓和上皮結構的固有膜。約一半的犬感染后迅速產生抗體，但不出現癥狀。另一半的感染犬體內病毒繼續增殖，廣泛侵害多個系統的上皮細胞，而呈現特征性的癥狀。

1.1.3 臨床癥狀 體溫呈雙相熱型。病初以呼吸道炎癥為主，表現為流涕、打噴嚏、咳嗽，常為干咳，嚴重時鼻鏡龜裂，呼出惡臭氣體，流膿性鼻液，堵塞鼻孔，張口呼吸呈腹式。肺部聽診，支氣管音粗厲，聞干性羅音或濕性羅音或捻發音?？梢曫つぐl紺，眼瞼周圍有散性出血點，眼瞼干燥，呈膿性眼結膜炎，角膜潰瘍，甚至穿孔。若以消化道炎癥為主時，主要表現為食欲不振或廢絕，嘔吐，腹瀉，排出帶有黏液的稀便，有時帶有血液。在后期出現非化膿性腦炎并導致神經癥狀，流涎，空嚼，體重不斷下降，腳墊和鼻過度角質化。有時全身肌肉振顫，轉圈，共濟失調，口吐白沫，牙關緊閉，最后抽搐而死。

1.1.4 臨床類癥鑒別 犬瘟熱在臨床上容易與感冒、呼吸道疾病、胃腸炎、犬細小病毒性腸炎、傳染性肝炎等相混淆，根據其臨床特征與犬瘟熱進行初步鑒別診斷。單純性胃腸炎時，無雙相熱型、無鼻、眼分泌物等。傳染性肝炎時，有黃疸等。犬細小病毒性腸炎嘔吐劇烈、頻繁、飲水后立即發生嘔吐，渴欲強烈，排出的番茄汁樣血便次數多、數量大。感冒時體溫升高，無雙相熱型，鼻流清涕，無流淚現象。而犬瘟熱雙相熱型，眼、鼻有分泌物，嚴重時有膿性分泌物；病犬飲水后較少發生嘔吐，初便秘，后腹瀉，糞便稀薄、惡臭，有時混有氣泡和血液；鼻、足墊過度角化；末期常出現腹痛、肌肉振顫等神經癥狀，甚至驚厥直至死亡。

1.1.5 病理變化 本病是一種泛嗜性感染，病變分布廣泛。有些病例皮膚出現水皰性皮疹；有些病例鼻和腳底表皮角質層增生而呈角化病。上呼吸道、眼結膜呈卡他性或化膿性炎。肺呈現卡他性或化膿性支氣管肺炎，支氣管或肺泡中充滿滲出液。在消化道中可見胃黏膜潮紅。卡他性或出血性腸炎，大腸常有過量黏液，直腸黏膜皺襞出血。脾腫大。胸腺常明顯縮小，且多呈膠凍狀。腎上腺皮質變性。輕度間質性附睪炎和睪丸炎。中樞和外周神經很少有肉眼變化。

1.2 實驗室常規診斷

1.2.1 包涵體檢查 包涵體主要存在于膀胱、膽管、膽囊、腎盂上皮細胞內。取清潔載玻片，滴加生理鹽水1滴，用小刀在膀胱黏膜上刮取上皮細胞，與生理鹽水混合研勻，制成涂片，置空氣中自然干燥后，用甲醇固定，蘇木精-伊紅染色后鏡檢。細胞核染成藍紫色，細胞漿呈淡玫瑰色，包涵體被染成紅色。包涵體大多在胞漿內，1個細胞內可能含有1~10個多形性包涵體，但一般呈現圓形或橢圓形。分別對用強毒攻毒、注射犬瘟熱疫苗和正常狐貉進行檢查，結果用強毒攻毒的狐貉發現了膀胱黏膜涂片中有包涵體的存在，而注射犬瘟熱疫苗組和正常對照組則無包涵體的存在，對于臨床發病動物檢查同樣可檢查出包涵體的存在。

1.2.2 Dot-ELISA法診斷 用建立的三抗體夾心法Dot-ELISA檢測犬瘟熱病毒(CDV)抗原，其抗原最低檢出量為1.15mg/ml(0.57625ng/點)，經與常規ELISA對104份自然感染犬的血液白細胞樣本，60份眼結膜分泌物樣本，73份脾、肝、淋巴結等臟器樣本進行檢測，檢測的陽性率分別為92.31%、66.67%、83.56%和90.72%、63.29%、81.86%；兩種方法檢出的總陽性率分別為83.54%(198/237)和80.17%(190/237)，總陽性符合率為95.96%，表明兩者呈高度正相關(r=0.92，P<0.01)。經電子顯微鏡觀察驗證比較，三抗體夾心法Dot-ELISA檢測的可信度為94.74%。

1.2.3 免疫組化法診斷 免疫組化技術是在抗原抗體特異反應存在的前提下，借助免疫化學的手段，檢測抗原(或抗體)在組織細胞內存在部位的一門新技術，目前已廣泛應用于人及動物傳染病的病原鑒定和快速診斷，極大地提高了傳染病的診斷和防治水平。從腦、脊髓、肺、腸、膀胱、脾和淋巴結中均可檢出CDV抗原，其中中樞神經系統和肺是診斷的最佳組織，脫髓鞘性腦炎和肺炎是犬瘟熱的主要病變。采用過氧化物酶法(PAP)技術檢查患犬瘟熱性肺炎的病犬組織，認為有病變的臟器組織均可檢出CDV抗原，且敏感性明顯高于包涵體檢查。采用PAP和單抗技術證實實驗性感染CDV脫髓鞘性腦炎病犬的腦組織中，不論是脫髓鞘部位還是未見明顯病變的白髓的神經膠質細胞中均可見到病毒抗原。陽性細胞包括星狀細胞、神經元細胞、室管膜細胞、脈絡叢細胞、腦膜細胞和血管周圍的炎性細胞。采用免疫熒光(IF)技術研究患犬瘟熱性腦炎病犬的CDV分布情況，結果從全部病犬的腦組織中均檢出CDV抗原，在灰質和白質中均可見到病變。在灰質中，抗原主要分布于神經元細胞中，包涵體呈成堆的大的顆粒樣或細小顆粒狀或粉塵樣聚集在胞漿中；在白質中主要存在于星狀細胞中。采用IF技術證實，在人工感染CDV后3~4d，即可從循環血單核細胞中檢出CDV抗原，病犬第一次發熱時最具傳染性。

1.2.4 犬瘟熱病毒的分離和鑒定 （1）病料的采集：采取何種病料，應根據疾病的類型和病情的發展情況而定。在體溫開始上升的病毒血癥早期，淋巴組織的感染最為嚴重，因此最好從淋巴細胞和淋巴組織分離病毒。對于急性病獸或急性死亡動物，病毒分布于全身各器官，故應從臟器中分離病毒。在慢性病例或疾病的中后期多從腎臟或腦組織分離病毒。（2）病毒分離：犬瘟熱病毒能夠適應雞胚和多種組織細胞培養物，但并非所有毒株都能生長良好。犬瘟熱病毒通過絨毛尿囊膜接種9~11日齡雞胚，經3~10代后，于接種后5~7d絨毛尿囊膜增厚，有的可引起豆斑。有報道認為，分離犬瘟熱病毒最好的方法是用犬和貂的巨噬細胞培養物，接種2~3d后出現圓形多核巨細胞。巨細胞容易脫落，而且并非所有的細胞都形成巨細胞，故應多次仔細觀察。（3）病毒的鑒定：通過電子顯微鏡檢查、酶標SPA染色和瓊脂擴散試驗等方法進行病毒鑒定。電鏡下觀察可見犬瘟熱病毒粒子呈現多形性，多數為球形，病毒粒子的直徑為110~550nm之間。核衣殼呈螺旋狀，總長度為1000nm，螺旋直徑15~19nm，螺旋中心5nm的孔，螺距5~6nm，核衣殼由囊膜包裹，其內部為M，厚約5nm，表面為H和F兩個糖蛋白組成的纖突，纖突長度為9nm。應用酶標SPA(葡萄球菌A蛋白)染色法對接種CDV的Vero細胞進行染色后發現，有相應CDV抗原部位，同樣滴加CDV陽性血清的對照細胞片，未見相應反應。CDV MD-77株感染后3、6、9、12h，胞漿可見細小陽性顆粒(呈淡黃色至棕褐色著染)；1d后陽性反應明顯增強，多見于胞漿，胞漿亦可見大空泡；2d后壞死細胞呈強陽性反應，細胞間拉網；3~4d后合胞體細胞呈強陽性反應，壞死細胞呈棕褐色至黑褐色；5d后陽性反應主要見于新生細胞胞漿；6d后合胞體細胞呈大圓形，陽性反應主要見于胞漿；7d后整個合胞體細胞呈一棕褐色大團塊；8d后大部分細胞脫落，殘留細胞呈強陽性反應。利用犬瘟熱雞胚成纖維細胞弱毒疫苗免疫動物制備瓊脂擴散抗體，并對患犬瘟熱病貉肝臟中的抗原進行檢測，與電鏡結果相比較，陽性符合率達85.7%，陰性符合率為75%，認為是一種較為特異、敏感、操作簡便的方法。

1.2.5 分子生物學診斷 隨著分子生物學技術的飛速發展，尤其是分子遺傳學的進步，大大提高了病毒的診斷水平，特別是核酸雜交、PCR技術的應用，大大提高了疾病診斷的準確性、敏感性和特異性。直接從死亡大熊貓肝臟提取細胞總RNA，經反轉錄后用犬瘟熱病毒的1對引物擴增出了約320bp的片段。此產物經純化、序列分析表明，其片段2個引物間長度為281bp，與預計片段大小相同。此毒株在核苷酸和氨基酸水平與北京犬野毒株、哈爾濱犬野毒株、某疫苗弱毒株、Onderstepoort弱毒株和海豹瘟熱病毒2型毒株的同源性分別為92.2%和98.9%、92.5%和98.9%、91.5%和94.6%、92.9%和98.9%、98.2%和100%。這樣就進一步確定了大熊貓的犬瘟熱病毒感染。用地高辛標記Ｎ基因互補的特異性RNA探針具有高度敏感性，可查證單個感染細胞中存在的目的核酸序列，特異性較強，不產生背景。運用RT-PCR已能檢測出患狗外周血單核細胞中的犬瘟熱病毒的核衣殼蛋白基因(N)及運用pRVSV載體成功表達了CDV的N基因。

目前，在獸醫臨床工作中，犬瘟熱的診斷多采用臨床診斷、包涵體檢查和ELISA法。對于病毒的分離、鑒定，免疫組化法和分子生物學等診斷方法，尚未推廣應用。

2 典型病例診治

2.1 發病情況

2011年12月20日，金東區曹宅鎮杜某家的牧羊犬4月齡，咳嗽，拒食，嘔吐，糞便中混有血樣黏液，主人帶狗來本處求診。

2.2 診斷情況

經問詢主人得知，該犬于11月初購于市區一寵物市場，之后一直養在自家，未進行過任何疫苗免疫，12月17日開始出現咳嗽。經檢查，該犬精神沉郁，眼角有跟眥，鼻部流有黃色膿性分泌物，打噴嚏，不愿活動，體溫為40℃，且呈雙相熱，糞便中混有血樣黏液。經流行病學調查和臨床癥狀觀察，初步診斷為犬瘟熱。

2.3 實驗室檢查

包涵體檢查：細心刮取支氣管黏膜上皮細胞涂片、自然干燥，用甲醇固定，蘇木紫—伊紅染色，鏡檢，在上皮細胞的胞漿或胞核內可見呈圓形或卵圓形、直徑1~2μm、呈紅色的包涵體。

2.4 治療

2.4.1 血清療法 使用犬瘟熱高免血清，2ml/kg體重皮下注射3d，做好緊急被動免疫。

2.4.2 對癥治療 用地噻米松5~20mg肌肉注射，1次/d，具有消炎和解熱作用；大量飼喂VB和VC，選用強心劑、利尿劑及收斂、止吐藥和止咳祛痰藥靜脈注射等。

2.4.3 控制繼發感染 為防止和控制繼發感染，按靜脈注射氨芐青霉素20mg/kg體重，肌肉注射。

2.4.4 轉歸情況 由于病情發現的較早，并得到很好的診治，一段有效的治療時間后，病情好轉。犬完全恢復后，按程序進行犬七聯苗的免疫，做好預防保健工作。

3 防制措施

3.1 免疫

定期預防接種是預防發生犬瘟熱的有效途徑。據筆者經驗，注意以下幾點：（1）采用正規廠家生產的疫苗，盡量使用聯數少的。犬瘟熱一細小病毒二聯苗從感觀上比五聯、六聯苗有效的多(尚未進行完全統計)，筆者曾用人用麻疹疫苗對7只未斷奶犬和4只斷奶犬進行首免，免疫劑量為1.5~2頭份，20d后用犬用五聯苗二免，二免后3個月用五聯苗三免，至今已6~7月齡，未發生犬瘟熱。（2）美國獸醫學會曾建議，免疫狀態不明的3月齡以下犬只應給兩劑或三劑以上疫苗。應對斷奶犬用二聯或五聯苗首免，免疫劑量2~3頭份，隔3周后二免，12~16周時三免，劑量為1頭份或2頭份。以后每年接種一次五聯疫苗。（3）改變接種途徑。文獻記載，靜脈或肌肉注射疫苗免疫產生快、效果好，皮下接種免疫產生慢且不確實。因此，最好采取肌肉接種方法。

3.2 自繁自養

加強獸醫衛生防疫措施各養殖楊應盡量做到自繁自養。個人養的犬，在本病流行季節，嚴禁將犬帶到犬集結的地方。

3.3 隔離

及時隔離治療發現病犬，要及時隔離治療，防止擴大傳播。目前尚無特異的有效療法。發病早期可應用本病康復犬血清或全血進行肌肉或皮下注射，劑量為血清4~5ml，全血10~15ml，有一定療效。此外，早期應用抗生素(如青霉素、鏈霉素等)，并配合對癥治療，對于防止細菌性繼發感染和病犬康復有重要的意義。

3.4 消毒

用3%燒堿溶液或10%福爾馬林徹底消毒犬舍、運動場地。

（2012–08–09）

S858.292

B

1007-1733(2012)11-0029-03