烏司他丁對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后炎性反應的影響

陳偉新 楊立群

（1.復旦大學附屬中山醫院青浦分院普外科，上海 201700；2.第二軍醫大學附屬東方肝膽醫院ICU，上海 200433）

文獻［1］報道烏司他丁（ulinastatin，UTI）預處理對大鼠肝臟缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷具有保護作用，它可以選擇性降低再灌注時活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生，并且減輕肝細胞的壞死和凋亡，但其具體機制目前尚不清楚。高遷移率蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種重要的內源性損傷相關分子，它廣泛分布于哺乳動物淋巴組織及腦、肝、肺、心、脾、腎等器官中，它在肝、腦組織中主要存在于胞漿，但在大多數其他組織中存在于胞核。生理狀態下HMGB1的表達量維持在極低的基礎水平［2］。HMGB1介導了內毒素誘導的膿毒癥，其是內毒素致死效應的晚期重要炎癥介質。HMGB1在體內不同器官分布廣泛，但目前尚無報道HMGB1是否參與了UTI抑制肝臟IR后炎性反應的過程，本研究旨在探討這一問題。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠40只，體質量250～300g，由第二軍醫大學實驗動物中心提供。大鼠在空調室內飼養，室溫22～25℃，自由進水和食物，術前12h禁食不禁水。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及模型的制作 首先將SD大鼠隨機分為4組。建立左、中肝門靜脈阻斷的IR模型，先阻斷大鼠門靜脈左、中分支45min，然后開放動脈夾再灌注2h。0.9%氯化鈉對照組（對照組，n＝10）：再灌注前5min尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液6mL／kg。UTI預處理組（UTI組，n＝10）：再灌注前5min尾靜脈注射 UTI（20U／mL）1.5mL／kg。UTI＋誘導劑組（UTI＋rHMGB1組，n＝10）：阻斷前1h予重組HMGB1蛋白10μg腹腔注射，余同 UTI組。UTI＋拮抗劑組（UTI＋Anti－HMGB1組，n＝10）：阻斷前1h予 Anti－HMGB1抗體100μg腹腔注射，余同UTI組。

1.2.2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血漿中細胞因子的水平 再灌注后取新鮮血液4～5mL，37℃靜置30min、4℃靜置2h后3 000r／min離心15min，小心吸取上層血清200μL裝于EP管中，采用TNF－α和IL－1特異性ELISA試劑盒，根據說明書步驟操作。

1.2.3 肝組織光鏡標本HE染色病理觀察 光鏡下評定肝組織損傷分級，其分級標準：0級，肝小葉、肝細胞、肝細胞索、中央靜脈、肝竇均正常；Ⅰ級，肝中央靜脈、肝竇內瘀血及少量肝細胞變性壞死，肝組織內可見炎細胞聚集，肝小葉結構完整；Ⅱ級，肝中央靜脈、肝竇內瘀血及較多肝細胞變性壞死，肝組織內炎細胞聚集較多，肝小葉結構尚完整；Ⅲ級，肝中央靜脈、肝竇內瘀血及廣泛肝細胞變性壞死，大量炎細胞聚集，部分肝組織結構破壞不完整。

1.2.4 肝臟組織HMGB1蛋白表達 采用免疫組織化學染色（S－P法）檢測。肝組織HMGB1表達結果判斷方法：在顯微鏡下觀察染色結果，陽性為細胞膜、細胞質或細胞核上棕黃色顆粒樣沉淀。－：細胞膜不著色，與背景一致；＋：膜呈棕黃色的細胞數＜25%或大多數細胞的膜呈淡黃色；＋＋：膜呈棕黃色的細胞數占25%～80%。

1.3 統計學處理 采用SPSS軟件進行相關數據統計分析，計算平均值、標準差，并進行正態性檢驗和方差齊性檢驗。對符合正態分布和方差齊性的資料進行單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用q檢驗。對不符合正態分布的資料和等級資料計算中位數（median，M）和四分位數（quartile，Q），進行非參數Kruskal－Wallis檢驗，組間兩兩比較采用Nemenyi法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）的比較 見表1。

2.2 各組血清細胞因子腫瘤壞死因子α（TNF－α）和白細胞介素（IL－1）含量的比較 見表2。2.3 肝組織病理學及HMGB1蛋白表達水平的改變 UTI組和UTI＋Anti－HMGB1組肝細胞壞死和中性粒細胞浸潤顯著輕于對照組，見圖1；且UTI組和UTI＋Anti－HMGB1組肝細胞 HMGB1的表達程度顯著低于其他兩組（P＜0.05），見圖2。

表1 ALT和AST在各組中的比較

表2 TNF－α和IL－1在各組中的比較

3 討 論

UTI是從人尿中提取精制的一種糖蛋白水解酶抑制劑，又稱尿胰蛋白酶抑制劑，其相對分子質量為67 000，它對胰蛋白酶、糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細胞彈性蛋白酶、透明質酸酶、琉基酶、纖溶酶等多種酶具有抑制作用。UTI分解形成的相對分子質量較低的成分也具有很強的抑制蛋白水解酶的作用［3］。本研究發現UTI預處理后，UTI組IR后血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）與對照組相比均顯著降低，表明UTI預處理對肝細胞具有保護作用。UTI組IR后血清TNF－α和IL1水平與對照組相比均顯著降低，表明UTI預處理是通過抑制炎性細胞因子的釋放發揮其對肝細胞的保護作用，病理觀察結果也證實了這一點。

高遷移率族蛋白（high mobility group，HMG）由Johns于1973年首次在牛胸腺中提取和鑒定，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中具有高遷移能力而得名。根據分子質量大小、序列相似性和DNA結構特性，HMG 可進一步分為 HMGA、HMGB、HMGN 3個家族。HMGB家族有3個成員，即HMGB1、HMGB2和HMGB3，三者在氨基酸序列上有80%的一致性。HMGB1是含量最豐富的HMG蛋白［4］。在正常情況下，HMGB1一部分存在于肝細胞胞漿中，一部分存在于肝細胞胞核維持DNA結構。當細胞壞死或受損時，核內的HMGB1可釋放到胞外，促使單核巨噬細胞分泌促炎因子；而促炎因子又反過來促進巨噬細胞主動分泌HMGB1，由此形成正反饋。IR誘導的肝損傷中，肝細胞大量壞死、細胞膜結構斷裂、胞核結構破裂，HMGB1被動釋放至細胞外，作為重要炎癥啟動因子介導IR后炎性反應。另外，在缺血的傷害性刺激因素作用下，肝臟內庫弗氏細胞主動分泌HMGB1至胞外。Tsung等［5］發現大鼠肝臟IR損傷后HMGB1的表達增強，其表達從再灌注后1h即開始上調并持續至再灌注后24h，且呈時間依賴性。通過本實驗我們證實了HMGB1可以拮抗UTI對肝臟IR損傷后炎性反應的抑制作用。

綜上所述，我們認為內源性損傷蛋白HMGB1介導的炎性通路與UTI對肝IR損傷的保護作用機制有關。

［1］ Jovin TM.HMG－1protein stimulates DNA end joining by promoting association of DNA molecular via their ends［J］.Eur J Biochem，2000，267（13）：4088－4097.

［2］ Li J，Kokkola R，Tabibzadeh S，et al.Structural basis for the proinflammatory cytokine activity of high mobility group box 1［J］.Mol Med，2003，9（1－2）：37－45.

［3］ Noie T，Sugawara Y，Harihara Y，et al.Kinetics of urinary trypsin inhibitor in patients undergoing partial hepatectomy［J］.Scand J Gastroenterol，2001，36（4）：410－416.

［4］ Bustin M，Lehn DA，Landsman D.Structual features of the HMG chromosomal proteins and their genes［J］.Biochim Biophys Acta，1990，1049（3）：231－243.

［5］ Tsung A，Sahai R，Tanaka H，et al.The nuclear factor HMGB1mediates hepatic injury after murine liver ischemiareperfusion［J］.J Exp Med，2005，201（7）：1135－1143.