高游離脂肪酸引起肺損傷的大鼠模型的建立

高遠 虞敏 施盛 金宇飚 袁忠祥

（上海交通大學附屬第一人民醫院心外科，＊病理科，上海 200080）

在肺脂肪栓塞和高三酰甘油胰腺炎患者中，游離脂肪酸（free fatty acids，FFA）是引起其肺損傷的主要原因。在心臟手術患者中，由于體外循環術需要注射大劑量肝素抗凝，而肝素可增強脂蛋白脂酶的活性，后者分解血三酰甘油（triglyceride，TG）產生FFA，故術中及術后會出現血FFA含量增高，這在高三酰甘油血癥（hypertriglyceridemia，HTG）患者中更明顯。我們的前期研究［1］已發現體外循環術后2h動脈血氧合指數與血FFA含量呈負相關，血FFA含量是術后低氧血癥（氧合指數＜200）的獨立危險因素，提示FFA可能與體外循環術后肺損傷有關。本研究通過建立大鼠HTG模型，注射肝素造成FFA升高，觀察肺損傷情況及辛伐他汀對此類肺損傷的保護作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 體質量250～300g成年雄性Sprague－Dawley大鼠56只，購于中國科學院上海實驗動物中心，在清潔級環境下飼養。

1.2 實驗試劑 辛基苯基聚氧乙烯醚（Triton WR 1339），購于美國Sigma公司。伊文思藍購于美國Sigma公司，甲酰胺購于上海永華化學品有限公司，辛伐他汀為杭州默沙東公司生產，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒均購于南京建成生物科技有限公司。

1.3 分組 將56只SD大鼠分為4組，每組14只。對照組：大鼠不予處理；HTG組：依據文獻［2］建立HTG大鼠模型，尾靜脈注射Triton WR 1339 75mg／kg，4h后取標本；FFA組：建立高游離脂肪酸模型，尾靜脈注射TRITON WR 1339 75mg／kg，2h后尾靜脈注射肝素3mg／kg，4h后取標本；他汀組：實驗前3d每天給予辛伐他汀3mg／kg灌胃，隨后建立高游離脂肪酸模型的方法同FFA組。

1.4 標本采集 4組動物建模完成后，各取8只采用10%苯巴比妥0.004mL／g腹腔注射麻醉，分離頸動脈，取動脈血5～8mL，取其中0.5mL立即行血氣分析，剩余血樣置于枸櫞酸抗凝管中高速離心，吸取血漿保存于－80℃冰箱待測。

1.5 伊文思藍試驗 4組各6只動物建模4h后，自尾靜脈注射2%伊文思藍溶液50mg／kg，15min后麻醉，放血處死，開胸自肺動脈以0.9%氯化鈉液灌洗肺血管，取肺組織0.2～0.3g，剪去周圍組織，將其浸泡在甲酰胺溶液中（10mL／g肺組織），置37℃溫箱中孵育72h，待色素全部浸出，取出肺組織，1500r／min離心10min后取上清液。

1.6 血漿標本處理 利用本院檢驗科大型生化分析儀（ADVIA2400，SIEMENS公司）測定血漿標本中總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG與FFA含量。采用硫代巴比妥法測定血漿MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定血漿SOD活力，酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒測定血漿IL－6、TNF－α、ET－1和ICAM－1含量。

1.7 病理檢查 將甲醛固定的肺組織標本常規脫水，石蠟包埋、切片、HE染色，于光學顯微鏡下讀片分析，由1名病理科醫師獨立讀片。

1.8 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件包進行統計學分析。數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析與兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 模型的建立及各組血脂指標比較 各組大鼠均成功完成實驗，無意外死亡。HTG組、FFA組和他汀組均成功建立高脂血癥模型，這3組的TC、TG和FFA均顯著高于對照組（P＜0.05）。FFA組FFA顯著高于 HTG組（P＜0.05），成功建立了高游離脂肪酸的模型。各組血脂指標比較見表1。

表1 4組血脂指標比較

2.2 各組動脈血氣指標比較 見表2。

2.3 各組脂質過氧化指標定量比較 見表3。

2.4 各組細胞因子指標定量比較 見表4。

表2 4組血氣指標比較

表3 4組脂質過氧化指標比較

2.5 肺組織伊文思藍含量比較 HTG組、FFA組、他汀組和對照組肺組織伊文思藍含量分別為18.38±0.57、26.29±1.28、17.96±1.48與16.62±0.56。FFA組顯著高于對照組（P＜0.05）；他汀組伊文思藍含量較FFA組顯著減少（P＜0.05），接近HTG組水平。

2.6 肺組織病理變化 光鏡下可見對照組大鼠肺組織肺間質寬度正常，無滲出，無炎癥細胞浸潤，見圖1－a。HTG組肺間質輕度增厚，少量淋巴細胞浸潤，見圖1－b。FFA組肺間質明顯增厚，并有淋巴細胞、漿細胞、少量中性粒細胞浸潤；毛細血管淤血，血管周圍淋巴細胞浸潤，病變較為明顯，見圖1－c。他汀組肺間質輕度增厚，毛細血管淤血，血管周圍少量淋巴細胞浸潤，病變顯著輕于FFA組，見圖1－d。

表4 4組細胞因子指標比較

圖1 4組大鼠肺組織的病理表現

3 討 論

文獻［3］報道，在人體和動物靜脈注射脂肪乳劑加肝素可制造高FFA狀態。本研究采用靜脈注射表面活化劑Triton WR 1339的方法成功建立大鼠HTG模型，再注射大劑量肝素造成類似體外循環時的高FFA狀態。

本研究中HTG組、FFA組和他汀組都有不同程度的肺功能損傷，表現為血氧分壓下降、肺毛細血管通透性升高、肺間質增厚和炎癥細胞浸潤、肺毛細血管淤血。HTG組肺損傷程度較輕，血氧分壓下降不明顯，毛細血管通透性增加和病理所見炎癥水腫較少。FFA組病變較重，血氣分析呈低氧表現，肺病理改變明顯，血管通透性增大，因為HTG組和FFA組TG含量近似，病變程度顯然與FFA濃度相關。他汀組血氣指標、病理、血管通透性均較FFA組有改善，提示辛伐他汀對FFA引起的肺損傷具有保護作用。

FFA引起肺損傷的機制尚不明確，本研究探討過氧化反應和細胞因子的作用。MDA水平可以反映機體內脂質過氧化的程度，間接反映出機體細胞受氧自由基損傷的嚴重程度；SOD活力高低反映機體清除氧自由基的能力。本研究中對照組、HTG組、FFA組中，隨著FFA水平的升高，MDA逐步升高，SOD相應降低，可提示FFA可能通過脂質過氧化途徑引起肺損傷。

我們的前期研究［1］發現，體外循環術后2h患者血中FFA含量與血ICAM－1含量存在正相關性，這一結果在本實驗中得到證實，4組的ICAM－1含量與FFA水平有大致平行關系，提示FFA可能通過ICAM－1途徑產生肺損傷作用。FFA的升高能直接誘導ICAM－1等黏附分子增加，ICAM－1被認為與肺血管內皮損傷有關，可以促進中性粒細胞與內皮細胞黏附，釋放一系列炎性介質、細胞毒性氧代謝產物及磷酯酶產物，使血管內皮細胞進一步損傷和激活，從而使血管內皮細胞通透性增強，這與本實驗結果中的病理表現和血管通透性改變相符［4－5］。

他汀類藥物是3－羥－3－甲基－戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，它除了可以降低TC和TG，還具有促進中性粒細胞凋亡、減輕中性粒細胞與上皮細胞間的相互作用、抑制脂多糖對TNF－α和IL－6的誘導，改善和修復血管內皮等功能，所以其除了降脂以外，還有對抗肺損傷作用。本研究中，他汀組與FFA組比較，TC、TG與FFA顯著降低；隨著FFA降低，肺氧合能力、肺病理及各過氧化和細胞因子指標均有明顯改善。與HTG組相比，他汀組的FFA仍較高，但SOD、ET－1、TNF－α較 HTG組改善，提示辛伐他汀具有降低血脂以外的抗炎和抗過氧化作用。

［1］ 虞敏，周黎瑾，董莉亞，等.體外循環術圍術期血中游離脂肪酸含量與肺損傷的相關性［J］.中國臨床醫學，2012，19（1）：14－16.

［2］ 楊體雄 周亞魁.輸注脂肪乳劑對伴高甘油三脂血癥胰腺炎大鼠胰腺的影響［J］.中華實驗外科雜志，2005，22（9）：1076－1077.

［3］ Azekoshi Y，Yasu T，Watanabe S，et al.Free fatty acid causes leukocyte activation and resultant endothelial dysfunction through enhanced angiotensin II production in mononuclear and polymorphonuclear cells［J］.Hypertension，2010，56（1）：136－142.

［4］ Mathew M，Tay E，Cusi K.Elevated plasma free fatty acids increase cardiovascular risk by inducing plasma biomarkers of endothelial activation，myeloperoxidase and PAI－1in healthy subjects［J］.Cardiovasc Diabetol，2010，9：9.

［5］ 李亞春，李穎川，周明.肺血管內皮細胞損傷與修復在急性肺損傷中的作用［J］.中國臨床醫學，2010，17（6）：819－821.