胃癌組織中microRNA－650的表達及其生物學作用和臨床意義

霍守俊 薛鋒 孔凡志 李芳 單遠州＊ 周聯明＊ 張學利＊

（1.蘇州大學，江蘇蘇州 215006；2.上海市奉賢區中心醫院骨科，＊普外科，上海 201400）

胃癌是全球高發的惡性腫瘤之一，胃癌患者的5年生存率僅約30%［1］，目前胃癌的發病機制尚不清楚。本課題組在前期研究中首次發現miR－650在胃癌中表達異常升高，并初步探討了miR－650在胃癌發生、發展及預后等方面的調控作用［2］。本研究旨在進一步探討miR－650參與胃癌發生的相關機制。

1 資料與方法

1.1 胃癌細胞株及培養 KATO III、NUGC4、NCI－N87、SGC－7901及 MKN－45胃癌細胞株的培養條件如下：KATO III培養液為 ATCC－formulated Iscove＇s Modified Dulbecco＇s Medium（IMDM）培養基（內含20%胎牛血清）；NUGC4、NCI－N87、SGC－7901及 MKN－45細胞株培養液均為RPMI－1640培養基（內含10%胎牛血清）；細胞孵育環境為：37℃且含95%空氣、5%CO2的培養箱。

1.2 臨床資料 根據美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）胃癌臨床實踐指南（2003版）中收錄的診療標準，共收集68例于2005年6月—2010年1月在上海市奉賢區中心醫院就診的胃癌患者，所有患者在確診胃癌后，限期行標準胃癌根治術并輔助放化療，全部患者至少隨訪2年以上。該項研究在征得患者及家屬同意后簽署知情同意書，并征得上海市奉賢區中心醫院倫理委員會同意。

1.3 試劑及儀器 iTRAQ試劑盒（美國ABI公司），SYBR PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），RNA提取試劑盒（德國 QIAGEN公司），IVIS Spectrum成像系統（美國冷泉港生物科技股份有限公司），LC－MS／MS系統（美國ABI公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 實時定量RT－PCR 從冰凍胃癌組織及其配對正常組織中以及5株胃癌細胞株中提取總RNA，檢測RNA純度，在miR分子末端加polyA尾，選擇Oligo dT引物，進行逆轉錄及PCR反應，記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數即Ct值，以U6snRNA作為內參，以2－ΔΔCt表示胃癌組織中miR－650表達量相對于正常組織的變化倍數，其中ΔΔCt＝（Ct－CtU6）癌－（Ct－CtU6）正常。腫瘤組織中 miR－650的表達量為正常組織表達量的3倍以上時為miR－650在胃癌組織中高水平表達。

1.4.2 慢病毒包裝及滴度測定 按說明書制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒及其兩種輔助包裝原件載體質粒，與Lipofectamine 2000混合后加入細胞培養瓶，置于CO2培養箱孵育，收集上清液，離心收集病毒濃縮液，分裝后取其中1支進行病毒生物學滴度測定，其余置于－80℃保存。

1.4.3 miR－650模擬劑和抑制劑 合成成熟 miR－650的引物，序列如下：正向：5’－AGGAGGCAGCGCTCTCAGGAC－3’。反 向：5’－CGGGCGCGTT－TTTTTTTTTTT－TTGTCCTGAGAG－3’。 miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸序列如下：5’－GTCCTGAGAGCGCTGCCTCCT－3’。以上序列與病毒基因組融合后，通過Lipofectamine 2000轉染胃癌細胞株。

1.4.4 細胞增殖分析 SGC－7901及 NCI－N87胃癌細胞株在轉染成熟miR－650序列及miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸后，置于CO2培養箱孵育，分別于第1、2、3、4天加入CCK－8試劑后在分光光度計下檢測450nm的吸光率。

1.4.5 細胞凋亡分析 SGC－7901及 NCI－N87胃癌細胞株在轉染成熟miR－650序列及miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸后，孵育、離心收集細胞，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.4.6 定量LC－MS∕ MS KATO III、NUGC4、NCI－N87、SGC－7901及 MKN－45胃癌細胞株在轉染成熟 miR－650序列及 miR－650抑制劑后，利用RIPA裂解液裂解細胞，將5種蛋白樣品分別進行還原和烷基化，經胰蛋白酶水解后，分別用不同的iTRAQ試劑進行標記，并將所有蛋白樣品混合，通過LC－MS／MS系統進行蛋白質定量分析以篩選靶蛋白。

1.4.7 蛋白質印跡（Western blot） SGC－7901及NCI－N87胃癌細胞株在轉染成熟miR－650序列及miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸后，提取其細胞總蛋白，進行western blot分析靶蛋白表達情況。

1.4.8 裸鼠異種移植模型 用含編碼綠色熒光蛋白基因的病毒轉染SGC－7901及NCI－N87胃癌細胞株后放入CO2培養箱孵育，取20只BALB／C裸鼠，隨機分為2組，每組10只，其中一組裸鼠腹腔注射SGC－7901細胞株，另一組裸鼠腹腔注射NCIN87細胞株，每周通過IVIS成像系統觀察腹腔腫瘤情況及裸鼠生長情況，6周后處死并打開腹腔觀察腫瘤大小、腹膜后淋巴結轉移及肝轉移情況。同時，另取20只BALB／C裸鼠隨機分為2組，每組10只，其中一組裸鼠腹腔注射SGC－7901細胞株，另一組裸鼠腹腔注射NCI－N87細胞株。每組裸鼠標記5只，每天腹腔給予miR－650抑制劑；同組中另5只裸鼠作為對照組，每天觀察腫瘤情況及裸鼠生長情況。

1.5 統計學處理 應用SPSS 17.0軟件包進行統計學分析，數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 胃癌中miR－650表達水平與患者術后生存期密切相關 胃癌患者術后生存期長短與miR－650表達水平密切相關，而與性別、年齡、腫瘤位置、TNM分期、淋巴轉移及遠處轉移等因素無相關性。見表1。

表1 胃癌患者預后相關因素分析

2.2 miR－650異常高表達可促進胃癌細胞增殖及轉移并抑制其凋亡 5株胃癌細胞株中，KATO III、NUGC4及SGC－7901細胞株高水平表達miR－650，而NCI－N87及MKN－45細胞株則僅微量表達miR－650（圖1）。細胞增殖分析結果顯示：與轉染了成熟miR－650序列的胃癌細胞株相反，當轉染miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸后，胃癌細胞株的增殖能力顯著下降（圖2）。流式細胞儀對凋亡水平檢測顯示，轉染miR－650抑制劑后，胃癌細胞株凋亡數量顯著增多（圖3）。裸鼠異種移植模型結果同樣提示，miR－650高表達可促進胃癌生長及轉移；而抑制miR－650表達后，可抑制腫瘤生長并抑制其遠處轉移及淋巴轉移（圖4）。

2.3 RGS7蛋白是miR－650的下游靶點之一，并受到miR－650的負性調控 成熟 miR－650序列及miR－650抑制劑轉染5株胃癌細胞株后，采用LCMS／MS系統蛋白定量分析。結果顯示：miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸轉染高表達miR－650的3株細胞株后，5種蛋白質的表達水平始終增加，分別是MMP2前體、SERBP1，DLL4，RGS7和PRDX1。然而，將成熟miR－650序列轉染入低表達miR－650的2株胃癌細胞后，有3種蛋白質的表達水平始終偏低，分別為S100PBP，RGS7及PRDX1（圖5）。綜合以上結果，可將RGS7蛋白及PRDX1蛋白視為miR－650的潛在靶蛋白。結合miR靶點預測軟件－Targetscan的篩選結果，最終確定RGS7蛋白為miR－650的下游靶點之一。通過western blot進一步證實：轉染成熟 miR－650序列后，胃癌細胞株RGS7蛋白表達量較對照組顯著下降，而當轉染了miR－650抑制劑－LNA寡核苷酸后，細胞中RGS7表達水平顯著上升（圖6），顯示出miR－650對RGS7蛋白的負性調控關系。

3 討 論

本研究發現，胃癌患者術后生存期長短與miR－650表達水平密切相關（P＜0.05），但是，患者生存期與患者性別、年齡、腫瘤位置、TNM分期、淋巴轉移及遠處轉移等因素無顯著相關性，可能由于受到樣本量及研究對象確定標準等因素的影響，故需進一步增加樣本量、重新制定研究對象納入標準及排除標準并改進研究方法后進行后續研究。

結合前期研究結果，我們假設：胃癌中miR－650的異常高表達通過促進胃癌細胞增殖及轉移并抑制其凋亡來促進胃癌的進展，進而影響患者生存期及預后狀況。為了驗證以上推論正確性，我們設計一系列實驗，研究結果提示：①抑制miR－650表達時胃癌細胞增殖能力受到抑制，而miR－650過表達后可促進胃癌細胞增殖；②抑制miR－650表達后可促進胃癌細胞的凋亡，反之，miR－650過表達可抑制胃癌細胞凋亡；③裸鼠胃癌異種移植模型結果同樣提示：miR－650可促進胃癌細胞增殖及轉移，而抑制其表達可抑制腫瘤生長并抑制遠處轉移及淋巴轉移。以上實驗結果與前期研究結果完全一致，但是仍不能明確miR－650下游除ING4以外的潛在靶點。我們綜合應用LC－MS／MS系統以及Targetscan軟件，最后確定RGS7為miR－650的下游靶點之一。RGS7屬于RGS蛋白亞族，RGS7家族成員包括：RGS6、RGS7、RGS9及RGS11等，受G蛋白信號調控［3］。RGS7由3個不同的結構域組成：①RGS區域：該區域相對保守，約120個氨基酸，存在于幾乎每個RGS家族成員結構中，通過結合Gα亞基促進GTP水解；②DEP區域：介導與膜錨定蛋白間相互作用；③GGL區域：與Gβ5亞基特異性結合，形成異二聚體調控視網膜細胞光反應、中樞神經元活動等過程［4］。為了探討miR－650表達與RGS7表達之間的內在聯系，我們通過western blot檢測miR－650對RGS7表達量的影響，結果發現兩者之間存在負性調控關系。

我們的研究結果初步提示，miR－650→RGS7及miR－650→ING4信號通路在胃癌形成過程中發揮作用，但胃癌的形成是一個多因素、多步驟相互作用、相互影響的復雜過程。隨著對miR與胃癌關系研究的深入，將逐步明確miR是否可以作為用于胃癌的早期診斷、治療及預后監測等的新型腫瘤標志物。

［1］ Shi Y，Zhou Y.The role of surgery in the treatment of gastric cancer［J］.J Surg Oncol，2010，101（8）：687－692.

［2］ Zhang X，Zhu W，Zhang J，et al.MicroRNA－650targets ING4 to promote gastric cancer tumorigenicity［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，395（2）：275－280.

［3］ Dai J，Gu J，Lu C，et al.Genetic variations in the regulator of G－protein signaling genes are associated with survival in latestage non－small cell lung cancer［J］.PLoS One，2011，6（6）：e21120.

［4］ Sandiford SL，Wang Q，Levay K，et al.Molecular organization of the complex between the muscarinic M3receptor and the regulator of G protein signaling，Gbeta（5）－RGS7［J］.Biochemistry，2010，49（24）：4998－5006.