異氟醚麻醉對老年大鼠海馬微管相關蛋白tau剪切的影響

張曉光 薛張綱 倉靜

（復旦大學附屬中山醫院麻醉科，上海 200032）

吸入麻醉藥可加重阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的神經病理改變。AD的神經病理特征為神經細胞外以β淀粉樣蛋白（amyloidβ，Aβ）沉積為核心形成斑塊，神經細胞內以過磷酸化的微管相關蛋白tau為核心形成神經纖維纏結（neurofibrillary tangle，NFT）和神經細胞丟失。有研究［1］顯示異常剪切的tau蛋白也是NFT的成分之一［1］。異氟醚可以促進γ分泌酶的作用，增加Aβ的表達，促進Aβ寡聚化，增加Aβ的細胞毒性［2］；它還可以活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase－3），誘發神經細胞凋亡，使β淀粉樣蛋白前體蛋白（amyloidβ precursor protein，APP）分裂酶和γ分泌酶的含量增加，并促進Aβ的表達［3］。但目前尚無報道表明異氟醚是否可以促進tau蛋白的剪切。Tau－C3是tau蛋白在D421位點被剪切后產生的片段。本研究旨在探討異氟醚麻醉對Sprague Dawley（SD）老年大鼠海馬Tau－C3含量的影響及其可能機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物處理 將16只Sprague Dawley（SD）老年大鼠（＞18個月）隨機分為對照組（n＝8）和麻醉組（n＝8）。將麻醉組大鼠置于氣密性良好有機玻璃麻醉箱中，進氣口與麻醉機呼吸回路相連，出氣口與麻醉氣體監測儀連接以監測麻醉箱內異氟醚、O2及CO2的濃度。載氣中O2濃度為40%，新鮮氣體流量為2L／min。當氣體監測儀上顯示異氟醚濃度達到1.5%時開始計時，使呼氣末異氟醚濃度維持在1.5%～2%，異氟醚吸入時間為6h。對照組吸入氣體中不含異氟醚，其他條件與麻醉組相同。觀察大鼠的呼吸頻率、幅度以及皮膚粘膜顏色。監測肛溫，將麻醉箱置于水浴中，使大鼠肛溫維持在35.5～36.5℃。

1.2 免疫組化多重標記 用8%水合氯醛腹腔注射（300mg／kg）麻醉大鼠后，迅速打開胸腔，暴露心臟，經左心室灌流200mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）后繼續灌注4%多聚甲醛溶液（Sigma－Aldrich）200mL；然后剝離腦組織，將其放入4%多聚甲醛，于4℃冰箱內固定48h。固定后用10%、20%和30%蔗糖溶液依次沉底后，進行冰凍切片，片厚度為15μm。自前中海馬部位開始切片，5張作為1套切片，每只大鼠取1套切片留備免疫組化染色。每張切片任意選取2個視野（×400），計數 Tau－C3陽性的細胞數、c－Casp3陽性的細胞數以及Tau－C3和c－Casp3均為陽性的細胞數。

1.3 免疫印跡法 將大鼠的海馬組織放入1.5mL Eppendorf管中，稱質量后，放入液氮中凍存。加入裂解液后在冰上用玻璃勻漿器勻漿后置于冰上裂解1h。以14 000r／min的速度于4℃ 離心30min，收集上清液并將其分裝后保存于－80℃。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測每個樣品的總蛋白濃度，并補加裂解液調整使各個樣品的蛋白濃度相近后，按照常規的免疫印跡法進行操作。

1.4 統計學處理 采用SPSS 10.0統計軟件進行統計學分析，數據以均值±標準差（ˉx±s）表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 麻醉組老年大鼠海馬Tau－C3的含量顯著高于對照組 麻醉組Tau－C3陽性細胞數為（5.6±2.4）個／高倍視野，而對照組為（2.5±1.2）個／高倍視野，2組間有顯著差異（t＝3.041，P＜0.01）。麻醉組Tau－C3免疫印跡條帶的相對光密度也顯著高于對照組，見圖1。

圖1 Tau－C3免疫印跡條帶及光密度統計圖

2.2 Tau－C3的增加與caspase－3的激活無關 免疫組化多重標記的結果顯示，95%的Tau－C3陽性細胞內并無c－Casp3，見圖2。

圖2 免疫組化多重標記實驗結果

2.3 異氟醚麻醉不能引起老年大鼠腦內的c－Casp3增加 免疫印跡的結果顯示，麻醉組和對照組老年大鼠腦內均僅檢測到極少量的c－Casp3，且2組間c－Casp3的含量差異無統計學意義，見圖3。

圖3 c－Casp3的免疫印跡條帶及光密度統計圖

3 討 論

近年來的研究［4］顯示異常剪切的tau蛋白在AD的病理中也占有重要地位。異氟醚是一種臨床常用的吸入麻醉藥，顯示異氟醚麻醉可以促進tau蛋白病的轉基因動物模型—tauP301L轉基因小鼠的tau蛋白磷酸化、聚集以及從微管上解離。

本研究發現異氟醚麻醉組老年大鼠海馬Tau－C3的含量顯著高于對照組。異氟醚促進tau蛋白磷酸化是由于異氟醚麻醉導致低體溫的原因。本研究中采取保溫措施，避免了低體溫的干擾，大鼠在麻醉過程中亦無缺氧的表現。

Xie［3］等通過一系列研究證實異氟醚在細胞水平可以增加caspase－3表達、誘導神經細胞凋亡及增加Aβ表達。研究顯示，AD轉基因小鼠腦內Tau－C3含量的增加與caspase－3激活無關［5］。通過免疫組化多重標記的方法，本研究發現在絕大多數Tau－C3陽性的神經元內并無c－Casp3存在；免疫印跡的結果也提示異氟醚麻醉并不能增加老年大鼠腦內c－Casp3的含量。由此我們推測異氟醚麻醉使老年大鼠腦內tau蛋白的剪切產物的增加與caspase－3的激活無關。

［1］ Zhang Q，Zhang X，Sun A.Truncated tau at D421is associated with neurodegeneration and tangle formation in the brain of Alzheimer transgenic models［J］.Acta Neuropathol，2009，117（6）：687－697.

［2］ Eckenhoff RG，Johansson JS，Wei H，et al.Inhaled anesthetic enhancement of amyloid oligomerization and cytotoxicity［J］.Anesthesiology，2004，101（3）：703－709.

［3］ Xie Z，Dong Y，Maeda U，et al.The common inhalation anesthetic isoflurane induces apoptosis and increases amyloid beta protein levels［J］.Anesthesiology，2006，104（5）：988－994.

［4］ Delobel P，Lavenir I，Fraser G，et al.Analysis of tau phosphorylation and truncation in a mouse model of human tauopathy［J］.Am J Pathol，2008，172（1）：123－131.

［5］ Zhang Q，Zhang X，Chen J，et al.Role of caspase－3in tau truncation at D421is restricted in transgenic mouse models for tauopathies［J］.J Neurochem，2009，109（2）：476－484.