肺炎衣原體誘發肺癌模型的建立

儲德節 潘春峰 郭水根 王靜 余竹元

（1.復旦大學附屬金山醫院呼吸內科，上海 201508；2.復旦大學附屬中山醫院，上海 200032）

近年來許多臨床流行病學方面的研究表明，肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，Cpn）慢性感染與肺癌的發生發展有關，Cpn感染已被確定為肺癌的危險因素［1］。但迄今為止，國內外尚無相關的動物實驗研究的報道。本研究擬用Cpn感染這個單一因素復制肺癌大鼠模型，同時選用香煙中所含的公認致癌物苯并芘（Benzopyrene，Bp）與Cpn聯合誘發大鼠肺癌，以期為進一步探討肺癌的預防和研究Cpn感染在肺癌發生和發展中的作用，為肺癌提供新的治療手段奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 Cpn菌株與實驗動物

1.1.1 Cpn菌株TW－183購自美國標準生物品收藏中心（American type culture collection，ATCC），保存于－70℃，用前將菌株濃度調整為6×106IFU／mL。

1.1.2 Wistar大鼠購自上海市實驗動物中心，體質量120～130g，雌雄各半，常規飼養7d后進行實驗。

1.2 動物分組和實驗方法 190只Wistar大鼠隨機分為4組：Cpn組、Bp組、Cpn＋Bp組以及對照組。除對照組為40只大鼠外，其余每組50只。Cpn組：單獨注入Cpn活菌株。方法為：用2%戊巴比妥鈉（0.23mL／100g）腹腔注射麻醉大鼠后，將其固定于實驗臺上；輕拉舌，壓迫舌腹部，暴露喉頭；在解剖顯微鏡直視下插入塑料套管針，當針管外口有氣流吹動棉花纖維時，則確定套管針插入氣管內，然后向大鼠氣管內注入100μL Cpn TW－183菌液（106IFU／mL）；注射完畢后立即將大鼠直立旋轉并輕輕按壓其胸部，以使菌液均勻分布于兩肺部；每周注射1次，持續2個月。Bp組：單獨注入Bp，操作參照羅素瓊等［2］的方法。Cpn＋Bp組：Cpn與Bp聯合注入。對照組不做任何處理。

1.3 檢測方法

1.3.1 組織病理學檢查 將大鼠處死后進行常規解剖，觀察每組大鼠的腫瘤發生情況。記錄肺癌的大體形態、瘤結顏色、硬度、炎癥及壞死情況；對肺癌組織進行固定，切片，在顯微鏡下觀察以明確病理診斷。

1.3.2 微 量 免 疫 熒 光 法 （microimmunofluorescence，MIF）檢測血清中Cpn特異性抗體 血清學診斷標準：IgA、IgM 滴度≥1：32為陽性，IgG滴度≥1：64為陽性［3］。

1.3.3 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測肺癌組織中Cpn的DNA 引物序列為，HL－1：5’－GTT GTT CAT GAA GGC CTA CT－3’；HR－1：5’－TGC ATA ACC TAC GGT GTG TT－3’。產物大小為437bp。

1.3.4 酶聯免疫吸附法檢測肺癌組織中Cpn特異性抗原 切片厚度為6μm，按照常規方法檢測。

1.4 統計學分析 計數資料用Stata軟件行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠生長情況 在試驗過程中除對照組全部存活外，其他3組大鼠因麻醉意外、感染等原因均有死亡個體出現。3個月后實存大鼠為：Cpn組48只，Bp組46只，Cpn＋Bp組43只。每月測量各組大鼠的體質量1次，3個月后除對照組外的其余3組大鼠體質量顯著增加，胸部有異物突出。第210天將各組存活的大鼠全部處死。

2.2 各組肺癌發生情況 對照組無大鼠發生肺癌，其余3組都有數目不等的大鼠發生肺癌。肺癌大小相差懸殊，大至300g，小的只有米粒大小。各組肺癌發生率及類型見表1。

表1 各組大鼠肺癌發生率

2.3 病理改變 3組大鼠的肺癌大小不一，腫瘤直徑為0.1～5cm，呈灰白色，質地較硬，大結節中間可見有壞死。肺癌的典型標本及病理診斷結果見圖1～4。

2.4 血清Cpn抗體檢測結果 在Cpn組和Cpn＋Bp組的大鼠血清中可檢測到Cpn的IgM、IgA和IgG，其中發生肺癌的大鼠血清中的IgA和IgG顯著高于未發生肺癌的大鼠。Bp組大鼠血清中未檢測到Cpn－抗體。結果見表2。

表2 各組大鼠Cpn感染率的比較及抗體的產生情況

2.5 PCR結果 PCR驗證肺癌組織中存在Cpn，結果見圖5。

圖5 Cpn感染誘發肺癌的PCR結果

2.6 肺癌組織中Cpn抗原檢測結果 Bp組大鼠肺癌組織均未檢測到Cpn抗原；Cpn組和Cpn＋Bp組大鼠的肺癌組織中均可檢測到Cpn抗原。

3 討 論

Cpn是一種常見的人類呼吸道病原體。普通人群中Cpn的感染率很高，據Lin等［4］報道，臺灣成年人血清中Cpn－IgG陽性率達45.5%。已有研究［5－9］表明，Cpn慢性感染與肺癌肺癌的發生有密切相關性，這些研究主要限于臨床流行病學研究；但也有研究［10－12］持反對觀點。為了更準確地評估兩者之間的相關性，Zhan等［1］采用meta－方法分析了12項研究的結果，涉及2 595份肺癌病例和2 585份對照案例，最終將Cpn感染確定為肺癌的危險因素。

但是，迄今為止尚無關于Cpn感染誘發肺癌的動物模型的報道。本研究采用Cpn感染以及Cpn感染聯合Bp的方法成功誘發肺癌大鼠模型。Cpn和Cpn＋Bp組Wistar鼠的Cpn感染率分別為72.9%和76.7%；2組的肺癌發生率分別為14.6%和44.2%，顯著高于對照組。本研究中Cpn－抗體陽性大鼠的肺癌標本中可以檢測到Cpn－DNA，且在Cpn組和Cpn＋Bp組大鼠肺癌組織中均可以檢測到Cpn抗原，由此證明大鼠肺癌的發生與Cpn感染密切相關。Bp是香煙中的重要致癌物之一，本研究中Bp組的肺癌發生率為10.9%，顯著高于對照組。Cpn組肺癌的發生率高于Bp組，但差異無統計學意義。Cpn＋Bp組肺癌的發生率顯著高于Bp組。由此可見，Cpn慢性感染是肺癌的另一個獨立危險因子。

Cpn慢性感染誘發肺癌大鼠模型的建立有望為肺癌的感染致病因素及防治開辟一條新途徑。然而，Cpn慢性感染致肺癌的發病機制目前尚不清楚，仍有待于進一步研究。

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