免疫與蛋白錯誤折疊擴增的超靈敏檢測抗原平臺

建立新型信號放大技術(shù)，對于提高檢測高靈敏和選擇性具有十分重要的意義。武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院何治柯課題組率先提出了一種基于蛋白質(zhì)錯誤折疊循環(huán)擴增（PMCA）技術(shù)的高靈敏可視化檢測抗原的新方法，相關(guān)成果發(fā)表在Anal. Chem.， 2012， 84（17）： 7343-7349。2001年Saborio課題組首次將瘋牛病相關(guān)蛋白（PrPSc）感染正常蛋白（PrPC）的原理用于腦脊髓液中微量PrPSc的檢測，并命名為蛋白質(zhì)錯誤折疊循環(huán)擴增（PMCA）。該技術(shù)被認為是人類生物學(xué)研究中里程碑式的進步，它不僅打破了人們以往認為只有核酸分子才能進行循環(huán)擴增的固有思維，同時為實現(xiàn)體液中致命性纖維樣蛋白的高靈敏檢測提供了新思路。與DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和滾環(huán)擴增反應(yīng)（RCA）等核酸分子擴增技術(shù)相比，蛋白質(zhì)錯誤折疊循環(huán)擴增的擴增對象為蛋白質(zhì)分子。在擴增循環(huán)中，錯誤折疊的蛋白可以誘導(dǎo)正常結(jié)構(gòu)的蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榕c之相同的錯誤結(jié)構(gòu)。這種轉(zhuǎn)變過程一般是快速且不可逆的，一旦正常蛋白中存在這類具有誘導(dǎo)酶活性的錯誤折疊蛋白，即使初始含量是極其微量的種子蛋白，在通過多次誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變循環(huán)后，其數(shù)量會發(fā)生百萬倍的提升，最終形成大量的錯誤折疊蛋白聚集體，并且整個誘變過程在恒溫下進行，無需額外的蛋白酶輔助就能進行高效反應(yīng)。

該研究首次將蛋白質(zhì)錯誤折疊循環(huán)擴增及陰離子熒光共軛聚合物引入到免疫分析中，實現(xiàn)了痕量抗原的可視化檢測。為了證實該方法的通用性，經(jīng)典的夾心免疫模型—凝血酶蛋白及其對應(yīng)的兩個適配體被選作為免疫反應(yīng)模型（操作過程如圖1所示）。實驗結(jié)果表明，該方法不僅具備PMCA系統(tǒng)出色的信號擴增能力，同時兼具可視化分析所特有的簡單、快捷等優(yōu)點。無需復(fù)雜的儀器和操作步驟就能夠?qū)崿F(xiàn)溶液中fM水平凝血酶分子的可視化檢測（見圖2），同時具有較寬的線性范圍（10至104 fmol/L）。該方法成功引入蛋白質(zhì)錯誤折疊循環(huán)擴增技術(shù)的免疫分析方法，不僅如此，與“immuno-PCR”和“immuno-RCA”等信號擴增免〖JP〗疫檢測方法相比，該方法不依賴復(fù)雜的設(shè)備和蛋白酶系統(tǒng)，就能實現(xiàn)生物分子的體外信號擴增及可視化檢測，為發(fā)展具有通用性的高靈敏抗原檢測平臺提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。