免疫與蛋白錯(cuò)誤折疊擴(kuò)增的超靈敏檢測(cè)抗原平臺(tái)

建立新型信號(hào)放大技術(shù)，對(duì)于提高檢測(cè)高靈敏和選擇性具有十分重要的意義。武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院何治柯課題組率先提出了一種基于蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增（PMCA）技術(shù)的高靈敏可視化檢測(cè)抗原的新方法，相關(guān)成果發(fā)表在Anal. Chem.， 2012， 84（17）： 7343-7349。2001年Saborio課題組首次將瘋牛病相關(guān)蛋白（PrPSc）感染正常蛋白（PrPC）的原理用于腦脊髓液中微量PrPSc的檢測(cè)，并命名為蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增（PMCA）。該技術(shù)被認(rèn)為是人類生物學(xué)研究中里程碑式的進(jìn)步，它不僅打破了人們以往認(rèn)為只有核酸分子才能進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增的固有思維，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)體液中致命性纖維樣蛋白的高靈敏檢測(cè)提供了新思路。與DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（RCA）等核酸分子擴(kuò)增技術(shù)相比，蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增的擴(kuò)增對(duì)象為蛋白質(zhì)分子。在擴(kuò)增循環(huán)中，錯(cuò)誤折疊的蛋白可以誘導(dǎo)正常結(jié)構(gòu)的蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榕c之相同的錯(cuò)誤結(jié)構(gòu)。這種轉(zhuǎn)變過(guò)程一般是快速且不可逆的，一旦正常蛋白中存在這類具有誘導(dǎo)酶活性的錯(cuò)誤折疊蛋白，即使初始含量是極其微量的種子蛋白，在通過(guò)多次誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變循環(huán)后，其數(shù)量會(huì)發(fā)生百萬(wàn)倍的提升，最終形成大量的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集體，并且整個(gè)誘變過(guò)程在恒溫下進(jìn)行，無(wú)需額外的蛋白酶輔助就能進(jìn)行高效反應(yīng)。

該研究首次將蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增及陰離子熒光共軛聚合物引入到免疫分析中，實(shí)現(xiàn)了痕量抗原的可視化檢測(cè)。為了證實(shí)該方法的通用性，經(jīng)典的夾心免疫模型—凝血酶蛋白及其對(duì)應(yīng)的兩個(gè)適配體被選作為免疫反應(yīng)模型（操作過(guò)程如圖1所示）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法不僅具備PMCA系統(tǒng)出色的信號(hào)擴(kuò)增能力，同時(shí)兼具可視化分析所特有的簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)點(diǎn)。無(wú)需復(fù)雜的儀器和操作步驟就能夠?qū)崿F(xiàn)溶液中fM水平凝血酶分子的可視化檢測(cè)（見(jiàn)圖2），同時(shí)具有較寬的線性范圍（10至104 fmol/L）。該方法成功引入蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的免疫分析方法，不僅如此，與“immuno-PCR”和“immuno-RCA”等信號(hào)擴(kuò)增免〖JP〗疫檢測(cè)方法相比，該方法不依賴復(fù)雜的設(shè)備和蛋白酶系統(tǒng)，就能實(shí)現(xiàn)生物分子的體外信號(hào)擴(kuò)增及可視化檢測(cè)，為發(fā)展具有通用性的高靈敏抗原檢測(cè)平臺(tái)提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。