利用孕婦血漿中胎兒游離DNA進(jìn)行無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前基因診斷的研究進(jìn)展

喻 瓊，鄧志輝

(深圳市血液中心，廣東 深圳 518035)

1997年，Lo等[1]首先發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中存在游離(cell-free)的胎兒DNA。直接利用孕婦外周血中的胎兒DNA，對(duì)胎兒的遺傳信息進(jìn)行無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前基因診斷，因無(wú)須穿刺或中止妊娠、對(duì)胎兒無(wú)任何創(chuàng)傷、可在妊娠早期進(jìn)行、適合于繼續(xù)妊娠對(duì)象等眾多的優(yōu)點(diǎn)，倍受臨床圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注和重視。

孕婦血漿中胎兒游離DNA源于胎兒細(xì)胞和/或胎盤的凋亡[2，3]，相對(duì)含量豐富，在妊娠早期平均為 0.022～0.46ng/ml， 妊娠晚期為 0.46～5.08ng/ml，孕中期和孕晚期的孕婦血漿DNA濃度高于孕早期[4]；并且分娩后，孕婦血漿中胎兒游離DNA很快被清除，不會(huì)影響到下次孕娠。因此，胎兒游離DNA成為當(dāng)前無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前遺傳分析的重要來(lái)源。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)、外已有較多的應(yīng)用研究文獻(xiàn)報(bào)道。

1 性別遺傳鑒定

目的是為了避免X-連鎖隱性遺傳性疾病，以利于優(yōu)生優(yōu)育。目前X連鎖隱性遺傳病有200多種，如杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良，女性攜帶者和正常男性婚配，女嬰為攜帶者的風(fēng)險(xiǎn)為50%；而男嬰則有50%的患病風(fēng)險(xiǎn)。在性別遺傳鑒定方面的研究，開(kāi)展較早，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多。如采用PCR技術(shù)、巢式PCR技術(shù)、熒光定量PCR方法檢測(cè)Y染色體上的SRY基因、鋅指蛋白基因(Zinc finger protein,Y-encoded,ZFY)，以及采用PCR復(fù)合擴(kuò)增和熒光法基因掃描檢測(cè)Y-STR等位基因，總符合率與孕周、血漿DNA提取方法及采用的檢測(cè)技術(shù)等相關(guān)，業(yè)已報(bào)道的總符合率介于90%～100%[5-8]。

2 RhD陰性孕婦的Rh(D)基因檢測(cè)

除胎兒性別鑒定外，首先引起研究者重視的是：Rh陰性孕婦的Rh(D)基因檢測(cè)[9]。Lo等采用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)12名早孕期、30名中孕期和15名晚孕期RhD陰性孕婦的血漿DNA，除2名早孕期的樣本因模板DNA量少、出現(xiàn)假陰性外，其余的55例樣本的Rh(D)檢測(cè)結(jié)果完全正確[4]。此后的研究者以Rh(D)基因的不同區(qū)域作為靶基因，相繼開(kāi)展了研究工作，取得了較為可靠的結(jié)果[10-13]，特別是中孕期以后孕婦樣本。

3 常染色體STR及X染色體STR基因座檢測(cè)

直接利用孕婦血漿總DNA，采用熒光法復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)胎兒的常染色體STR等位基因，可獲得男嬰或女嬰的STR遺傳多態(tài)性信息。熒光法的檢測(cè)所需模板DNA量少、檢測(cè)靈敏度高、人為因素造成的誤差小。Pertl等[14]自行合成、標(biāo)記熒光引物，建立復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，檢測(cè)12對(duì)母-子對(duì)，9個(gè)STR位點(diǎn)中至少可檢出4個(gè)父源性胎兒STR等位基因，檢出率為80%。Nelson等[15]采用熒光法單個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增GATA72E05等5個(gè)X-STR基因座，檢測(cè)25例孕娠女嬰的孕婦血漿DNA，19例(76%)至少檢出了一個(gè)胎兒特異性等位基因，并建議中孕期的孕婦血漿DNA可用于STR遺傳分析。

以往的研究[14，15]只能證實(shí)：可以檢測(cè)到孕婦不具有的、父源性胎兒STR等位基因(Informative STR allele)，但不能得到明確的胎兒STR基因型；胎兒DNA組分占孕婦血漿總DNA的比例少，若檢出的STR基因峰值低、又恰好處在母親的STR等位基因影子帶的位置，則難于區(qū)分是胎兒的STR基因峰，還是母源性STR等位基因的影子帶。因此，根據(jù)胎兒游離DNA與母源性DNA分子大小的差異，探索有效方法，從孕婦血漿總DNA中富集胎兒DNA，減少母源性DNA的干擾，可顯著提高胎兒特異性的STR或X-STR基因峰的峰高，Li Ying等[16]研究結(jié)果可證明這一點(diǎn)。

4 Y染色體特異STR基因座分型

人類Y染色體特異STR基因座(Y-STR)，為人類男性所特有，理論上與正常女性DNA的反應(yīng)結(jié)果為陰性；特別是在女性DNA含量較高的背景下，受女性成分的干擾小，因而在法醫(yī)DNA物證鑒定及無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前分子遺傳診斷中具有特殊應(yīng)用價(jià)值。鄧志輝等[7]采用ReliageneTMY-PLEX 6熒光復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)中的6個(gè)Y-STR基因座，檢測(cè)53份孕期為11～36孕周的孕婦血漿DNA，結(jié)果29例孕男嬰的孕婦血漿DNA均檢測(cè)出清晰的Y-STR等位基因，每例平均檢出1.8個(gè)基因峰，檢出的等位基因與對(duì)照組中“丈夫”的Y-STR基因一致。而24例孕女嬰的孕婦血漿DNA均未檢測(cè)出Y-STR特異性等位基因。研究還發(fā)現(xiàn)：擴(kuò)增產(chǎn)物片段較短的基因座，等位基因檢出率較高，如DYS393基因座PCR產(chǎn)物大小為113～139 bp，檢出率為100%(29/29)；而PCR產(chǎn)物片段較長(zhǎng)的基因座，檢出率較低，說(shuō)明了胎兒DNA主要是短片段DNA分子組成；改變PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，如增加PCR反應(yīng)中模板DNA量、增加DNA聚合酶用量、增加PCR循環(huán)數(shù)、采用二次PCR擴(kuò)增，均未能提高YSTR等位基因的檢出率。

根據(jù)胎兒DNA的分子特征，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)一步縮短Y-STR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度，采用擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在180 bp以下的9個(gè)Y-STR基因座組成熒光復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，檢測(cè)30例孕娠男嬰、34例孕娠女嬰的孕婦血漿DNA[8]，結(jié)果孕娠男嬰的孕婦血漿DNA，可檢出4-9個(gè)Y-STR等位基因，平均每例檢出7.3個(gè)，9個(gè)等位基因全部檢出的占12/30；大大提高了Y-STR等位基因的檢出率[8]。研究表明：Y-STR分型除了可應(yīng)用于胎兒性別遺傳鑒定外，還可獲得男性胎兒遺傳多態(tài)性信息，可應(yīng)用于孕娠男嬰孕婦的無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前親子鑒定的排除。

5 非整倍性染色體病

Lo等[17]采用定量PCR技術(shù)檢測(cè)Y染色體特異DNA序列，發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中21染色體三體綜合癥(唐氏綜合癥)胎兒的DNA濃度顯著升高(1.97倍以上)；Farina等[18]報(bào)道孕婦血漿中唐氏綜合癥胎兒的DNA平均濃度為對(duì)照組的1.7倍；根據(jù)孕婦血漿中胎兒DNA濃度增高并結(jié)合其它業(yè)已建立的血清生化指標(biāo)，為21三體綜合癥的篩查提供了可能[9]。研究還發(fā)現(xiàn)：孕婦血漿中13三體綜合癥胎兒DNA濃度顯著升高[19]，但18三體綜合癥胎兒游離DNA的濃度與正常對(duì)照組差異不大[19，20]；說(shuō)明不同的胎盤病理?xiàng)l件下，導(dǎo)致胎兒DNA水平的差異。

6 存在的問(wèn)題和展望

直接利用孕婦血漿中胎兒游離DNA進(jìn)行無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前基因診斷，簡(jiǎn)便實(shí)用，具有廣泛的應(yīng)用前景。業(yè)已開(kāi)展了胎兒性別鑒定、父源性血型基因檢測(cè)、各類STR遺傳標(biāo)記檢測(cè)、胎兒非整倍體病的診斷等應(yīng)用研究，但當(dāng)前尚難于作為成熟的技術(shù)獨(dú)立應(yīng)用于臨床。

如何避免母源性DNA的干擾，是影響實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素之一。孕婦血漿總DNA，其中大部分為母源性DNA，只有少部分 (約5～7%)為胎兒DNA[2，4]。在以PCR為基礎(chǔ)的分子遺傳診斷中，混合DNA樣本中兩種不同DNA組分所占的比例是至關(guān)重要的，含量高的模板DNA組分會(huì)產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增，而胎兒DNA含量少(如小于5%)，可能會(huì)被漏檢。此外，源于胎兒細(xì)胞和胎盤細(xì)胞經(jīng)凋亡產(chǎn)生的DNA分子的片段大小，不同于母體血漿DNA分子。母血中胎兒DNA的片段長(zhǎng)度要短于母源性DNA，＞99%胎兒 DNA的片段長(zhǎng)度在 313bp以下[14，21]。若以100bp SRY序列的相對(duì)濃度為100%,則137bp時(shí)相對(duì)濃度占67%，193bp僅占20%，而313bp時(shí)未檢出[21]。因此，孕婦血漿中胎兒DNA不僅是濃度和純度較低，而且主要是短片段DNA分子，這在進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前分子基因診斷中是不能忽視的。

大規(guī)模并行基因組測(cè)序技術(shù)(massively parallel genomic sequencing)能夠檢測(cè)大量的DNA片段[22]，已應(yīng)用于唐氏綜合癥的診斷研究[23，24]。近年來(lái)，Lo等[25]直接利用孕婦的血漿DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得了完整的胎兒及孕婦的基因組序列，構(gòu)建了全基因組遺傳圖譜，為直接利用胎兒游離DNA開(kāi)展無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前基因診斷開(kāi)辟了新途徑，具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著母血中DNA、mRNA等基礎(chǔ)研究的深入，以及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前胎兒分子遺傳診斷將不斷取得新的突破，從而對(duì)臨床和法醫(yī)DNA物證鑒定等產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

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