酪蛋白膠束結構研究方法綜述

史 瑩，楊 敏，梁 琪，* ，喬海軍，張衛兵

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070;2.甘肅農業大學理學院，甘肅蘭州730070;3.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅蘭州730070)

牛乳蛋白質通常分為酪蛋白(casein，CN)和乳清蛋白，各自含量約占乳中總蛋白的80%和20%，依品種不同有變化;酪蛋白是乳中一大類蛋白質的總稱，是乳中主要的蛋白質成分，由 αs1-、αs2-、β-、κ-CN四部分組成，質量比大約為 4∶1∶4∶1 左右，平均等電點在4.8;四種單體可以通過在水相中疏水作用和靜電排斥作用的平衡形成CN膠束［1-2］。常乳中大約80%～95%的CN以膠體分散粒子的形式存在，稱為膠束，其中包含94%的蛋白質干基和6%的膠體磷酸鈣［3］。CN被廣泛用在食品、化妝品和一些其他的日常用品中，因此CN膠束的性質和結構被大量研究。掃描電鏡、透射電鏡、電泳、反相高效液相色譜、動態光散射、超聲波光譜、紫外-可見分光光度計等技術廣泛用于CN膠束結構的研究中。

1 酪蛋白膠束結構的研究方法

1.1 內部結構

CN膠束的內部結構至今無法觀察，許多學者提出了各種理論模型，以下三種模型被廣泛接受:亞單元模型，該模型認為，15～20個CN單體分子通過疏水相互作用組成一個個亞單元，根據κ-CN的含量又分為富含和少量的κ-CN亞單元，亞單元和磷酸鈣連接形成 CN膠束;內部結構模型，認為 αs1-、αs2-、β-CN位于膠束的核心，κ-CN位于膠束的表面，起保護作用;微簇結構模型，認為CN分子與磷酸鈣纏繞在一起，磷酸鈣分布在膠粒的內部，κ-CN在膠束表面形成毛發層結構為膠束提供靜電相互作用或電荷，維持CN粒子的穩定性［4-7］。微簇結構模型在2003年提出后被廣泛接受。

1.2 表面結構研究方法

CN膠束表面接近球形并且不光滑，在亞結構之間存在間隙［5］。膠束表面κ-CN的分布不均勻，從表面突起并自然延伸，直徑大約在50～600nm，平均直徑在150nm［8］。對CN膠束表面結構的研究主要通過掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡。

1.2.1 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)近年來，掃描電子顯微鏡觀察CN膠束的表觀結構已經被廣泛應用，工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子，次級電子的多少與樣品的表面結構有關。該手段能觀察CN膠束不光滑的表面并且能測定粒徑的大小。通過電子顯微鏡觀察CN膠束的形狀是球形，直徑在50～500nm之間［3］。

普通的SEM分辨率比較低，不能清楚地描述表面結構，觀察到的CN膠束是球形。而近幾年通過高分辨率的掃描電鏡觀察到是近球形，比普通膠束更大，直徑在300～350nm之間，CN膠束的表面比簡單的由相對較短的毛發覆蓋的硬球體更加復雜。CN膠束結構比簡單的球形模型有更多的“面”，表面相當不規則，表面積比球形大。一些κ-CN只是管狀模型的終止，不需要均勻的覆蓋“球形的”表面，更接近CN的真實表面結構［9］。

1.2.2 透射電子顯微鏡(transmissionelectron microscopy，TEM)透射電子顯微鏡的原理:由電子槍發射出來的電子束，在真空通道中通過聚光鏡將之匯聚成一束光斑，照射在樣品上，電子束攜帶樣品的內部結構信息，在熒光屏上成像。在低分辨率時不能提供有關結構的信息，因此一些學者用冷凍透射電子顯微鏡(cryo-TEM)和高分辨率的TEM觀察CN膠束的結構，成功地觀察到了脫脂乳的CN膠束結構，發現CN膠束的表面結構有點粗糙并且不規則，膠束的形狀沒有出現完全的球形［10］，并且有一個相當不規則的外圍結構，從表面上看，CN被組織成蛋白質鏈相互糾纏的網絡結構，內部結構自然的延伸并在表面突出［11］。通過高分辨率的TEM觀察CN膠束的結構，McMahon［12］等人提出了CN膠束的超分子結構，盡管在CN膠束內部允許相當大的變化，但其仍是一個非常開放的結構，通過磷酸鈣納米簇上的蛋白質鏈的環環相扣來自我強化;在超分子矩陣結構內閉合的空間將由牛乳中溶解的乳糖、離子和其他可溶性物質的乳清占據。由此可見，高分辨率和冷凍的TEM能夠成功的觀察CN膠束的表面結構，且兩者都被許多學者廣泛應用。

1.2.3 原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)原子力顯微鏡有一根納米級的探針，通過檢測樣品與探針之間的原子排斥力來反映樣品表面形貌和其他表面結構，可以分辨出極小尺度上的表面細節和特征。通過該手段觀察發現，牛乳CN在高壓下，原始膠束的直徑減小，解離程度大于聚集程度［13］。在高壓下，CN表面形態相當不均勻，復合物易碎，膠束連續不斷的分解，最終完全分解成單體［14］。

目前，酪蛋白膠束表面結構常用的觀測手段為上述三種電子顯微鏡。SEM和TEM的前處理比較復雜，容易破壞CN膠束的結構;TEM對待測樣品有厚度和形態上的要求，并且要求在電子線照射下不損壞或發生變化;AFM避免了復雜的前處理以及電子束輻射損傷等的限制，具有很高的橫向分辨率和縱向分辨率［15］。將AFM和其他儀器結合起來，相互取長補短，在未來將會有更好的應用前景。

2 酪蛋白膠束解離與聚集的測定方法

在酶、熱和高壓等各種外界因素的作用下，CN膠束的穩定性會發生變化。這些變化包括酶凝過程中的解離和聚集，蛋白質水解、絮凝、凝膠作用和脫水收縮作用等［16］。酶促反應過程中κ-CN的Met106鍵首先會發生水解，使CN膠束發生解離，生成兩種多肽:一種是N-末端的para-κ-CN，仍然和CN膠束連接著，而C-末端的多肽(糖巨肽)，被釋放到乳清相中［17］。這些變化都可通過電泳、反相-高效液相色譜、超聲波光譜、擴散波光譜、動態光散射、粒度儀和紫外分光光度計測定。這些方法又可分為直觀的測定和通過樣品溶液的理化指標來測定兩種，其中電泳和反相高效液相色譜法可直觀測得CN膠束的解離;而其他幾種方法是通過測定溶液的指標來說明膠束的解離與聚集。

2.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的電泳方法。蛋白質是兩性電解質，組成CN膠束的單體分子量和電荷不同，根據解離程度，溶液中的單體含量在改變，電泳可分析這四種單體的變化，因此可將其分離。十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和光密度計連接后，可成功分析凝乳酶作用脫脂乳過程中κ-CN的水解，κ-CN的水解和para-κ-CN的合成是同時進行的，兩者之間的關系呈線性負相關［17］。這些結果表明SDS-PAGE能用來檢測酶解脫脂乳中的κ-CN。采用Urea-PAGE分析發現，CN的水解過程中，γ-CN、β-CN的水解產物增加。研究表明，CN被水解成各個單體:γ1-、γ2-、γ3-、β-、αs1-CN、蛋白眎、蛋白胨;β-CN被逐步水解并在24h內完全水解［18］。Urea-PAGE圖能很清晰的展示纖溶酶處理的脫脂乳中β-CN的大量水解。根據SDS-PAGE電泳條帶的強度發現，酶交聯的β-CN在酸性條件下具有較高的穩定性，能抵抗胃蛋白酶的消化［19］。上述這些研究結果可以充分地表明電泳方法可以成功的用來分析CN的水解。然而，通過電泳分析只能定性說明膠束解離與聚集的過程。

2.2 反相高效液相色譜法(reversed－phase highperformance liquid chromatographic，RP－HPLC)

反相高效液相色譜法，一般用非極性固定相，流動相為水或緩沖液。CN在解離或聚集的過程中，通過RP-HPLC可以測得單體的含量，進行定量說明。Thoma［20］等人通過RP-HPLC方法定量的測定了CN的水解產物糖基化巨肽和非糖基化巨肽，發現此方法的準確度和精密度都很好。Aline［21］等人用RP-HPLC分離CN和它們的脫磷酸產物，通過峰的保留時間對各個單體的分離以及脫磷酸產物成功地進行了確定。

電泳和液相色譜法是測定CN膠束解離的兩種常見方法，樣品處理都相對簡單，干擾小、進樣量少、操作簡單、靈敏度高，是直觀測定CN膠束解離的手段，快速、準確。

2.3 超聲波光譜法(ultrasonic spectroscopy)

超聲波光譜法通過測定溶液的粒徑來動態觀察CN膠束的解離與聚集，通過測定超聲速率和衰減量的變化來表征CN膠束的解離與聚集。傳統的超聲波有分辨率限制，超聲波速率的最高分辨率是0.1m/s，不能測量凝膠過程。最新引進的高分辨率的超聲波光譜能使超聲速率測量有更高的分辨率，可達0.2mm/s。

用超聲波光譜法可以研究酶凝、酸凝和乳清蛋白的熱凝膠系統，超聲波實驗可以證明凝膠的出現、明確反應的不同階段，但不能詳細的說明其中細節［22］。超聲波光譜可以和流變學結合使用，更加有利于對酪蛋白解離或聚集細節的研究。Wang［23］對比超聲波和振蕩流變學方法發現，通過超聲波的方法測量CN酶法水解和聚集過程效果更為明顯，但對CN凝膠的形成不敏感。通過高分辨率的超聲波光譜和動態流變學、近紅外透射結合分析酶凝過程中牛乳微結構的動態改變，結果發現，由于κ-CN“毛發層”水解膠束聚合成的簇，膠束的平均粒徑降低然后形成凝膠結構，超聲波對聚合物的散射能很好的描述酶凝過程中超聲衰減的變化［24］。高分辨率的超聲波光譜能低強度、無損的分析牛乳形成的凝膠微觀進程的細節，必將有廣闊的應用前景。

2.4 擴散波光譜(diffusing wave spectroscopy，DWS)

擴散波光譜可以檢測酶凝過程中CN膠束大小的改變，以此來分析CN膠束的聚集。DWS對粒徑大小的變化很敏感，能夠用來檢測粒徑大小的變化及 CN 膠束的聚集［25］。Alexander［26］等人通過 DWS測粒徑大小，粒徑迅速增加能成功表征凝膠點，CN膠束半徑的小幅度減小是由于κ-CN毛層的坍塌和移除。此實驗可以說明DWS結果可以成功的分析CN膠束的解離與聚集。DWS還可以成功的觀察酶凝過程中表觀半徑和濁度的變化:酶凝過程中脫脂乳的濁度和表觀半徑都是增加的［27］。DWS還可以用于酸奶和干酪的加工中檢測CN膠束的聚集。DWS是一種較為先進的方法。

2.5 動態光散射(dynamic light scattering，DLS)

近幾年光散射方法發展迅速，主要由于其對樣品是非侵入性的;簡便、快捷;實驗成本比較低;樣品不需要任何處理(除稀釋之外)。光散射需樣品滿足“單一散射原則”，因此需要對樣品進行高度稀釋［28］。章宇斌［29］等人用DLS測定了膠束尺寸并研究了CN膠束在各種因素下的聚集行為，熱處理導致流體力學半徑(Rh)不斷減小，Rh隨蛋白濃度和離子強度先減小后增大。Qi［30］等人通過DLS說明蛋白酶加入后的0～120min，Rh增加;120～180min 時，Rh逐漸趨于穩定，這些結果成功表明CN加入蛋白酶后發生聚集。粒徑大小或分布的改變能為膠束的聚集和解離提供有效信息，能幫助預測膠體系統的穩定性和一系列宏觀性質。不同因素影響下，CN膠束會發生不同程度的解離和聚集，DLS能快速、無創的測量CN膠束的粒徑。但是，通過DLS測粒度分布時，采用不同稀釋劑和不同溫度，粒度分布是不同的［31］。

2.6 粒度儀(Particle Size Analyser)

國外用DLS和DWS研究CN的較多，而用粒度儀測量CN膠束大小并不多見。McSweeney［32］等人通過馬爾文粒度分析儀測得模擬乳化液加熱之前pH在6.8時，粒徑分布在 10～100μm;pH6.9 時，1～10μm;pH≥7.0，粒度分布在＜1μm，此結果可以說明調節pH可以增加CN膠束的穩定性;粒度儀能成功測量CN膠束的粒徑。

粒度儀在測定CN膠束粒徑方面的報道比較少，激光光散射粒度儀報道相對較多，但是其原理和光散射原理一樣，這里不再介紹。光散射具有無損、無耗、快速、檢測溫度適宜、信息量多、操作簡便快速等優點，但缺點也很明顯，必須要對樣品進行高度稀釋，這就限制了其應用。而擴散波光譜是一種無干擾、無侵入的光散射技術，不需要對樣品進行稀釋，適用于稠密的未稀釋樣品多重散射的光測量。

紫外可見分光光度法是通過測定溶液的濁度變化說明CN膠束穩定性的。

2.7 紫外可見分光光度計(UV－visible absorption spectroscopy)

由于各種物質具有不同的分子、原子和不同的分子空間結構，其吸收光能量也不盡相同，可根據吸收光譜判別物質是否發生聚集和解離。在600nm下，用紫外可見分光光度計(UV-可見)測CN膠束溶液的吸光度，發現10℃和30℃CN聚集方式相似，但10℃時聚集速率慢［33］。Hidalgo［34］等人用 UV-可見說明加熱使κ-CN穩定性發生變化，并在聚集之前構象發生改變或局部解離。

UV-可見是研究物質的成分、結構和物質相互作用的有效手段，具有靈敏度高、分析速度快、應用廣泛等特點。

3 展望

牛乳中含有豐富的蛋白質、脂肪、礦物質等營養物質，CN是乳蛋白中一大類磷蛋白，近年來許多學者對CN膠束的結構、影響因素、酸凝及酶凝機理等進行了研究，但由于其結構的復雜性，至今為止，CN膠束的內部詳細結構尚不清楚，只提出了一些理論結構模型，CN膠束內部結構的研究方法和手段是今后研究的重點，有待于學者深入探究。

研究CN膠束的解離與聚集的手段中，超聲波光譜和擴散波光譜更先進、無損，與傳統的方法相比，超聲波光譜可以低強度、無損的分析樣品，能透過光學上不透明的樣品，更適合牛乳系統的研究;擴散波光譜適用于研究光學不透明稠密體系中凝固(膠凝)、聚合、絮凝和聚集過程，對粒徑的變化很敏感;紫外通過測溶液的濁度來分析樣品，快速、簡便，而前處理較其他方法比較復雜，但由于儀器的價格較其他先進儀器低廉，因此普及度高，應用廣泛;超聲波光譜儀和擴散波光譜儀價格昂貴，對于這兩種方法研究CN膠束的穩定性在國內罕見報道，因此應用受到限制，但鑒于具有多種優點，相信在以后的研究應用中會越來越廣泛。

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