日糧與牛組織中穩定性碳同位素的相關性研究

孫豐梅，王慧文，石光雨，楊曙明

（1.河北北方學院食品科學系，河北 張家口075131；2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京100081；3.河北北方學院牧業工程系，河北 張家口075131）

＊隨著社會經濟的發展，人們生活水平的提高，我國人民的食物需求已從溫飽型向小康型轉變，消費類型從歷史上的糧食為主變為肉、蛋、奶消費增加［1］，隨之而來的動物性食品特別是牛肉的食品安全問題成為人們日益關注的焦點。由于瘋牛病、口蹄疫等人畜共患傳染病的發生，消費者強烈要求獲知動物性食品來源的真實信息。瑞士聯邦公共衛生局調查顯示，82%的消費者購買食品的主要依據是知曉食品的產地來源［2］。歐盟食品法規規定從2005年1月1日起在歐盟范圍內銷售的所有食品在生產、加工和流通的各個環節都能追溯［3］。為此，在牛肉生產中急需建立完整的追溯系統。

穩定同位素分析技術在過去的三十年間，已在食品生產的某些領域如蜂蜜、果汁、葡萄酒［4－6］等鑒別食品成分摻假和證實食品產地的真實性中得到成功應用，并且有些同位素分析方法已得到官方分析化學家協會（AOAC）及歐洲標準化委員會（CEN）的承認［7］。近年來，在追溯動物性食品的地理來源如牛乳、奶酪、黃油、牛羊肉［8－14］等，以及牛的飼料［15－17］成分中的應用增多，并且被認為是追溯產品產地的一種有效的、有潛力的方法。光合作用是植物將太陽能轉化為化學能的過程，依據其光合作用的不同而分為C3植物、C4植物及CAM類植物，植物適應光環境作用的能力很大程度上決定了它的分布模式［18］。C3植物進化程度低，較為原始，主要分布在北方溫帶和寒帶，而C4植物進化程度高，適宜生長溫度較高，在南方熱帶和亞熱帶地區生長較多［19］。研究表明，日糧碳同位素組成不同，影響動物組織中的δ13C值，這主要依賴于C3、C4光合作用植物在飼料中所占的比例，因此動物組織中的δ13C值是反映其飼料的良好指示物［15］。Boner和Forstel［14］及Schmidt等［11］指出，牛肉粗蛋白質中的δ13C值可作為有機養殖的判斷指標（主要是在北方的溫帶和寒溫帶），因為有機養殖的飼料主要是C3植物（牧草），而傳統養殖主要是C4植物（玉米ZeaMays）。在牛肉需求量日益增長的今天，為了獲得較高的日增重和日產奶量，過多的精飼料用于其中（主要為玉米），因此，越來越多的研究要求將穩定同位素方法作為一種定量技術來推斷C3、C4植物成分在日糧中所占的比例［17］。

研究了日糧中C3和C4飼料組成不同時，牛不同組織中δ13C值的變化規律，以建立牛組織中δ13C值和膳食中C4植物比例間的劑量響應關系，為穩定同位素溯源技術在我國牛肉生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

2007年11月，在北京金維福仁有限公司養殖場，選擇體質健康、體重大小一致、年齡為12～14月齡的西門塔爾雜種公牛18頭作為試驗動物，隨機分為6組，每組3個重復，每個重復1頭牛。試驗從11月20日正式開始，至2008年4月1日結束，所有試驗用牛被屠宰。日糧配方分為兩部分，一部分為基礎日糧，一部分為C4植物部分，具體配比量見表1（干物質計）。在基礎日糧的基礎上分別添加0%，20%，40%，60%，80%和100%C4植物部分。按照配比量計算，1～6組的C4植物在整個日糧中所占比例分別為52.0%，61.6%，71.2%，80.8%，90.4%，100%。

表1 日糧配方Table 1 Dietary formula

1.2 飼料樣品

在試驗過程中，分別采取各種飼料原料。將各種原料60℃烘干48 h，粉碎，粗飼料玉米青貯過0.177 mm篩，其他原料過0.149 mm篩。

1.3 牛尾毛樣品

在試驗開始前取每頭牛的牛尾毛部分，試驗結束時，在原來取牛尾毛的部位再取牛毛。參考Schwertl等［20］，郭波莉等［21］及De Smet等［16］的處理方法。剪取靠近根部6 cm的牛尾毛樣品，用去離子水浸泡清洗，在60℃恒溫干燥12 h，用甲醇∶氯仿（2∶1）混合液浸泡2 h進行脫脂，用去離子水清洗、浸泡30 min，再用甲醇∶氯仿（2∶1）混合液浸泡2 h。最后用去離子水清洗，60℃烘干，剪成1～2 mm備用。試驗結束時將整段牛尾毛處理作分析用。

1.4 牛肉及脂肪樣品

屠宰時取牛后臀部肌肉500 g，至－20℃冰箱保存。取牛肉樣品大約50 g用陶瓷刀切成厚2 mm的薄片，放至冷凍干燥機中干燥。樣品完全干燥后，切碎，再用研缽充分研磨至粉末狀。用濾紙包好后在索氏提取器中用無水乙醚提取6～8 h，收集脂肪至聚乙烯瓶中。濾紙包及聚乙烯瓶中的樣品待乙醚充分揮發后，將脫脂干物質（主要為粗蛋白）過0.074 mm篩后轉移至自封袋中，與粗脂肪樣品保存在4℃冰箱，直至分析。

1.5 穩定性碳同位素測定

取大約1.0 mg樣品，用錫箔杯包裝好后通過自動采樣器送到元素分析儀（Flash EA1112型）。在此樣品中的碳元素轉化為純凈的CO2氣體，然后進入Thermal Finnigan DELTAPlusXL同位素質譜儀進行檢測。

穩定同位素在自然界含量極低，用絕對量表達同位素的差異比較困難，因而國際上公認使用相對量來表示同位素的富集程度，計算公式為：

式中，R－重同位素與輕同位素豐度比，即13C／12C。國際通用的標準物質是美國南卡羅來納州PeeDee建造中白堊系的擬箭石（PDB）。

1.6 數據處理

數據以平均數±標準差表示。利用SPSS軟件作單因素方差分析的多項式比較，即作線性和二次分析。利用EXCEL軟件作相關和回歸分析。

2 結果與分析

2.1 飼料的δ13 C值

各 種飼料原料的δ13C值測定結果顯示（表2），植物的光合作用方式不同，其δ13C值顯著不同。現今植物界中90%的植物屬于C3植物，δ13C值在－21‰～－32‰之間；C4植物的δ13C值較高，在－12‰～－19‰之間。玉米面、玉米酒糟、玉米青貯均屬于典型的C4植物，其δ13C值較高；而大豆粕、棉籽餅、小麥麩和小麥粉為C3植物，其δ13C值在－25‰～－28‰之間。由于牛的飼料種類多，多為人工混合，又有秸桿和牧草等粗飼料，難免混合不均勻，因此對飼料原料分別取樣，根據其在各組中所占的比例，按δF混合＝δF1X1＋δF2X2＋……＋δFnXn（δF，每種飼料的δ13C值；X，每種飼料所占的百分比例）計算每組混合飼料的δ13C值（表3）。通過計算，每組飼料的C4植物含量與其δ13C值呈高度相關（R2＝1，P＜0.01）。

表2 各種飼料原料的δ13 C值Table 2 Theδ13 C values of feed material

2.2 試驗開始與結束時牛尾毛中碳同位素的變化

試驗開始及結束時，牛尾毛的δ13C值測定結果顯示（圖1，表3），試驗前每組試驗牛的δ13C值分散程度很高，變異系數范圍在8.9%～23.1%；而當試驗結束時，相應的每組牛的δ13C值趨于一致，變異系數均大大降低，其范圍在0.89%～8.11%。剛購買來的牛因來源于不同地區，個體之間的碳同位素組成差異較大，給其喂養相同飼料，隨著時間的推移，各組中不同個體的牛尾毛的碳同位素組成差異減小。由此可以推斷，試驗前隨機分配到每組的牛，它們的飼料成分不相同，同時說明牛組織中碳同位素組成主要受飼料的影響，而個體對其的影響很小。

表3 飼喂不同含量的C4植物日糧時牛不同組織的δ13 C值Table 3 Theδ13 C values of cattle tissues in different C4 content

2.3 牛不同組織中碳同位素組成情況

試驗結束時，隨著C4植物含量在牛飼料中的比例增大，對應各組飼料的δ13C值也隨之增大（表3）。牛尾毛、脫脂肌肉、粗脂肪中的δ13C值均隨著C4植物比例的升高而逐漸增加，這種變化在牛尾毛中最為明顯。進一步的方差分析結果表明，無論是在牛的哪一種組織中，各組之間的δ13C值差異均達到極顯著水平（P＜0.01）（表4），不僅如此，多項式比較結果顯示，在3種牛組織中，6個處理組間δ13C值均存在著線性關系（P＜0.01）（表4），但二次項比較結果均不存在關系（P＞0.05）（表4），不同C4植物含量的處理組別中，牛組織的δ13C值存在顯著差異，并在各組之間存在有線性關系。然而，在脫脂肌肉和粗脂肪中，δ13C值卻出現了反常現象，即并不是每一組中的δ13C值都隨著C4植物含量的增加而增加，如第5組脫脂肌肉和脂肪中的δ13C值反而高于第6組的，并且值比較接近，出現這一現象的原因可能是因為碳同位素在牛不同組織中的代謝更新速度不同造成的，碳同位素在牛尾毛中的更新速率最快，而肌肉和脂肪中則較慢。

2.4 牛組織中碳同位素組成與飼料的相關及回歸分析

通過對牛尾毛、脫脂肌肉、粗脂肪中的δ13C值與飼料中C4植物百分含量所作的相關性分析可以看出，它們之間均呈極顯著相關性（P＜0.01）。牛尾毛中的δ13C值與飼料中C4植物百分含量相關性最高，相關系數為0.99；其次是脫脂肌肉，相關系數為0.96；而粗脂肪的相關性最低，但也達到了高度相關，相關系數為0.94。將飼料中C4植物百分含量與牛尾毛、脫脂肌肉、粗脂肪中的δ13C值分別作一元回歸分析（圖2），這些結果說明利用C4植物在飼料中所占的比例可以預測出牛組織中的δ13C值。同樣地，也可用牛組織中的δ13C值估測飼料中C4植物所占的比例，其準確性增加的順序依次為粗脂肪、脫脂肌肉、牛尾毛。在本研究中，如飼料中C4植物所占的比例變化10%（95%置信度水平下），δ13C值在牛尾毛、脫脂肌肉、粗脂肪中產生的變化分別為1.2‰～1.4‰，0.9‰～1.0‰，0.7‰～0.8‰。

2.5 牛尾毛與脫脂肌肉、粗脂肪中碳同位素的相關性

試驗結束時每組中牛尾毛的δ13C值最高，脫脂牛肉次之，粗脂肪中的最低（表3，圖3）。但三者之間的相關性達到極顯著水平，脫脂牛肉與牛尾毛、粗脂肪的相關系數分別為0.904（P＜0.001）（圖3）和0.869（P＜0.001），牛尾毛與牛肉粗脂肪的相關系數為0.814（P＜0.001）。

圖1 各處理組試驗前和結束時牛尾毛δ13 CFig.1 Theδ13 C value of cattle hair for each group in beginning and end

表4 牛不同組織中不同處理組別的δ13 C值多項式比較（線性和二次項分析）Table 4 Results of polynomial（linear and quadratic）forδ13 C values of different groups in cattle tissues

3 討論

3.1 混合飼料的δ13 C值

青貯玉米營養價值高，氣味芳香，柔軟多汁，適口性好，是奶牛、肉牛一年四季特別是冬春季節的優良飼料［22］，因此，在本試驗設計中，C4植物部分使用了大量的青貯玉米，而C3植物則使用了麩皮、棉籽餅、大豆餅和小麥粉。因實際需要，在本次試驗過程中，飼料中還添加有少量的食鹽，小蘇打及膨潤土，三者在每組飼料中的比例僅為0.15%。郭波莉等［21］報道，牛組織中的碳同位素組成取決于主飼料成分，少量的濃縮飼料、添加劑等對其影響很小。因此此類添加劑對混和飼料的δ13C值影響忽略不計。

圖2 牛不同組織中δ13 C與C4植物含量關系Fig.2 Relationship between the content of C4 plant andδ13 C value of different tissues

圖3 脫脂牛肉與粗脂肪中δ13 C值相關關系Fig.3 Correlation ofδ13 C value between lipid－free muscle and lipid

3.2 牛不同組織中碳同位素組成與飼料的關系

食用相同飼料，同一品種的牛個體間δ13C值無差異，不同品種的個體間差異較小，飼料對牛各組織中δ13C值的影響遠大于品種對其的影響［21］。本試驗結果與此一致，隨著時間的延長，同一品種飼喂同一飼料的牛個體間δ13C值差異逐漸減小。

牛組織中的δ13C值與其飼料密切相關。本試驗中，牛尾毛、脫脂肌肉、粗脂肪與飼料中δ13C值、C4植物比例呈極顯著相關性，這種關系有助于不同的養殖場用來推測C4植物在飼料中所占的比例。當脫脂肌肉中的δ13C值為－20‰時，認為屠宰前24周，牛飼料中至少含有50%的C4植物［14］。Bahar等［17］報道，脫脂牛肉與脂肪中的δ13C值與膳食中的碳含量呈高度相關。本研究結果與此一致。De Smet等［16］研究發現，牛屠宰后，不同組織如腎臟的脂肪、肝臟、血液、血漿和肌肉中的δ13C值與牛最后育肥階段飼料的δ13C值呈高度正相關，相關系數變化范圍在0.92～0.99。但牛毛樣品與最后育肥階段飼料中的δ13C值相關性未達到顯著水平。他們所用的牛毛樣品取自頸部，在試驗開始前，在牛的頸部選取一部位剪掉其毛發，最后屠宰時，又在同一部位取其毛發。分析牛毛中的δ13C值與屠宰前最后階段飼料中δ13C值的相關性，即在每一階段更換飼料前，未重新剪掉毛發，而且在每一階段，喂養牛的飼料有很大差異，造成牛毛中的δ13C值與飼料中的δ13C值相關性降低。造成這種結果的原因是，他們用整段牛毛樣品來分析，前面兩階段長出的牛毛對檢測結果會產生影響，使其與最后育肥階段的飼料相關關系不明顯［16］。牛尾毛主要由結構蛋白角蛋白構成，在生長過程中，角蛋白形成在皮下幾毫米處，一旦角蛋白的結構確定，毛發組織的代謝就會停止，每段毛發記錄的同位素信息為生長時的食物信息［20］。本研究中，在試驗開始前，從根部剪掉了牛尾毛，整個試驗期內，每組牛的飼料都未改變，因此試驗結束時毛發中的δ13C值反映的就是當時的飼料信息。因此，在以牛尾毛作為試驗樣品時，應根據飼料改變時間和牛尾毛生長速度來確定取樣段位。

3.3 牛尾毛與脫脂肌肉、粗脂肪中碳同位素組成關系

在每一組中，牛尾毛中的δ13C值最高，脫脂肌肉次之，粗脂肪中的最低，而且這三者之間有極顯著的相關性，這與郭波莉等［21］的報道一致。并且在每一組中，δ13C值在牛尾毛中的變化均小于肌肉中的（表3），這似乎可以說明牛尾毛中的碳同位素更新速率高于肌肉中的。Bahar等［17］指出，單純用一種組織中的δ13C值不足以用來估計牛飼料中的C4植物含量，原因是肌肉中的碳同位素更新率較慢，而脂肪組織相對更新較快。脂肪在合成過程中對13C有貧化作用，因此其δ13C值相對較低。但是從本研究的結果來看，似乎并不能說明脂肪中的碳同位素更新速率高于肌肉組織，這與Bahar等［17］的報道并不一致。

牛尾毛與其肌肉、脂肪組織中的δ13C值高度相關，這說明可用牛尾毛代替肌肉進行牛肉產地溯源的研究。根據資料報道，牛尾毛的最低生長速度為0.51 mm／d［23］。因此可根據牛育肥期的長短，從根部剪取合適的一段牛尾毛進行分析，即可反映牛育肥期的飼料信息，這樣將使同位素溯源技術的應用更為簡便。

4 結論

牛組織中碳同位素組成主要受飼料的影響，隨著時間的延長，飼喂同一種飼料的牛個體間碳同位素組成差異減小。

牛尾毛、脫脂肌肉、粗脂肪中的δ13C值隨著C4植物含量在牛飼料中的比例增大而升高，并且均與C4植物含量呈現極顯著的相關性。用牛組織中的δ13C值可以預測食物中C4植物所占的比例。

牛尾毛、脫脂肌肉、粗脂肪中的δ13C值依次降低，三者之間相關性達到極顯著水平。這說明各組織中碳同位素組成變化趨勢一致，均可作為牛肉溯源的材料。

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