杜仲活性成分的提取及分離純化方法研究進展

潘亞磊，翟遠坤，武祥龍，梅其炳,2

(1.西北工業大學生命學院，陜西 西安 710072；2.第四軍醫大學藥理教研室，陜西 西安 710032)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)，又名木棉(木草圖經)，為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木，我國特有的藥用植物，國家二級保護植物。杜仲活性成分在抗腫瘤、防治骨質疏松、治療心腦血管疾病、抗衰老、增強免疫力、安胎等方面有著良好的功效[1]，因此，杜仲活性成分的提取及分離純化越來越受到人們的重視。

作者在此對杜仲活性成分的提取及分離純化方法進行綜述，以期為杜仲活性成分的開發與綜合利用提供幫助。

1 提取方法

1.1 水提法

水提法是以水為溶劑，大多輔以加熱等方式，從杜仲中提取易溶于水的成分(如綠原酸和多糖等極性較大的化合物)。

王茜等[2]比較了水、不同濃度乙醇、甲醇和丙酮水溶液等提取溶劑對杜仲葉綠原酸得率的影響，通過正交實驗對綠原酸得率的主要影響因素進行了分析，結果表明，50 ℃水提綠原酸得率比較高，為1.06%，從而確定水作為綠原酸提取溶劑，在優化條件下粗產品綠原酸得率為76.51%、純度為30.88%。魏銳等[3]利用響應面分析法優化了杜仲葉綠原酸的水提工藝，綠原酸的提取率達92.55%。董娟娥等[4]用10%的堿水在100 ℃下以提取過藥用有效成分后的杜仲葉為原料提取酸性多糖，并優化了工藝條件。袁菊麗[5]用水超聲提取杜仲皮中多糖，以多糖含量和得率為指標，優化了提取工藝條件，杜仲皮多糖得率為1.72%。

水提法具有成本低、無污染、能耗少、操作簡便等優點，但適用范圍較窄，對于不易溶于水的成分提取率低。

1.2 乙醇提取法

乙醇是一種良好的溶劑，通過調整乙醇和水的比例，可以滿足大多數活性成分的提取需要。

都國棟[6]用50%乙醇在pH值約為4、體系溫度為50 ℃的條件下，回流振蕩浸提杜仲葉2次，每次提取3 h，綠原酸提取率超過95%，浸膏提取率約43%，綠原酸含量28%。陳曉青等[7]研究發現，65%甲醇和72%乙醇對桃葉珊瑚苷的浸提效果最好，當乙醇濃度高于72%時，浸提率下降，同時隨著提取劑濃度的增大，所提取溶液的顏色加深、粘度增大，給后處理帶來困難。考慮到提取溶劑的毒性及生產成本，選擇72%乙醇作為提取溶劑。

乙醇提取法具有成本低、提取效率高、耗時短、清潔無污染、適用范圍廣、可提取杜仲中多種活性成分、溶劑容易回收、可重復利用等優點。

1.3 超聲提取法

超聲提取法是利用超聲波的空化作用、機械作用、熱效應等加快物質分子運動頻率和速度，增大溶劑穿透力，從而提高目標成分浸出率的方法[8]。

超聲作用可以改變植物的組織，破碎細胞，加速溶解有效成分，促進擴散和傳質。超聲提取適用于多種天然植物有效成分的提取，如生物堿、萜類化合物、黃酮化合物、脂質和揮發油等[9]。鄧翀等[10]以甲醇和水為溶劑，采用超聲法對杜仲葉中總木脂素進行提取，并通過正交實驗對超聲提取時間、甲醇濃度、溶劑用量等3個因素進行了優化，結果發現超聲提取時間影響顯著，優化條件下的木脂素平均含量達0.8843%。陳偉[11]通過正交實驗確定超聲浸提杜仲葉中綠原酸的最佳工藝條件為：乙醇濃度30%、提取時間30 min、料液比1∶25、提取次數3次，綠原酸含量達到0.4113%；超聲浸提杜仲葉中總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度50%、提取時間20 min、料液比1∶20、提取次數3次，總黃酮含量達到1.4639%。齊惠麗[12]采用水提法、醇提法和超聲法提取杜仲葉中綠原酸，結果發現，超聲法得率最高、溶劑用量最少、提取時間最短。

超聲法具有省時、節能、高效等優點，并且提取中無加熱過程，因此可避免加熱引起的藥物成分結構變化，能用于熱敏性成分的提取[13]。

1.4 微波提取法

微波又稱超高頻率電磁波，是一種波長在1～1000 mm(相對頻率為300～300 000 MHz)的電磁波。微波提取技術主要是基于微波具有的熱特性，可以使物料被加熱，從而促進有效成分的溶出。加熱原理主要有兩個方面：一方面是通過介電損耗，具有永久偶極的分子在2450 MHz的電磁場中產生共振頻率，使分子高速旋轉，平均動能迅速增加，從而升高溫度；另一方面是通過離子傳導，離子化的物質在超高頻的電磁場中超高速運動，因摩擦產生熱效應[14]。高頻電磁波到達物料內部后，由于吸收微波能，物料內溫度迅速升高，細胞瞬時破碎，被提取物進入提取介質中，從而提高提取效率[15]。

Li等[16]應用二元正交分析法對微波輔助水提杜仲中京尼平苷酸和綠原酸的提取時間、微波功率、溶劑用量和溶劑組成等條件進行了優化，京尼平苷酸和綠原酸的提取時間分別為40 s和30 s，大大縮短了提取時間。陳偉[11]應用微波輔助法提取杜仲葉中綠原酸和總黃酮，確定微波浸提杜仲葉中綠原酸的最佳工藝條件為：乙醇濃度70%、提取時間25 min、料液比1∶30、微波功率600 W，綠原酸含量達到0.3425%；微波浸提杜仲葉中總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度50%、提取時間25 min、料液比1∶30、微波功率400 W，總黃酮含量達到0.7672%。彭密軍[17]將微波提取技術應用于杜仲活性成分提取，同時與常規浸提、超聲波提取等方法進行比較，結果發現微波提取效果最佳。

微波提取法具有提取時間短、效率高、溶劑消耗量少、易于操作、節能、無污染等優點，已廣泛應用于天然產物中有效成分的提取[18]。

1.5 酶提取法

酶是一種生物反應催化劑，具有高效性、專一性和反應條件溫和的特點。在藥用植物有效成分提取過程中，當存在于細胞原生質體中的有效成分向提取介質擴散時，必須克服細胞壁及細胞間質的雙重阻力，應用纖維素酶作用于藥用植物材料，使細胞壁及細胞間質中的纖維素、半纖維素等物質降解，減小細胞壁、細胞間質等傳質屏障對有效成分從胞內向提取介質擴散的傳質阻力，從而提高有效成分提取率[19]。

彭小文[20]考察了纖維素酶、果膠酶以及兩者混合對綠原酸提取率的影響，結果顯示，綠原酸提取率隨著酶量的增加而上升，當纖維素酶加量為0.02%時提取率達到最高，但此后再增加酶量，提取率不再升高；優化酶作用的溫度、pH值、時間等條件后，綠原酸的提取率穩定在92.0%左右。袁靜等[21]采用分步添加纖維素酶和果膠酶的方法提取綠原酸，先在pH值為5、溫度為45 ℃時加入纖維素酶作用10 min，然后在pH值為4、溫度為55 ℃時加入果膠酶作用10 min，最后用水提取杜仲葉中綠原酸，處理并重結晶后得到純品，結果表明雖然酶法比傳統方法粗產品產量少，但由于其中雜質含量低，綠原酸含量提高5.7%，綠原酸提取率也提高2.4%。Luo等[22]研究發現，酶法提取杜仲葉中抗氧化成分比水提法效率更高，酶提取法是替代常規方法的一種有效方法。

酶提取法具有提取時間短、提取率高、雜質含量低、無溶劑殘留、所需設備簡單、可操作性強等優點。酶反應在較溫和的條件下將植物組織分解，使有效成分暴露出來，較大幅度地提高了藥物有效成分的提取率和純度[23]，且其溫和的反應條件有利于保持提取物的生物活性，在熱敏性物質提取中具有獨特的應用。但酶法目前在杜仲有效成分提取中的應用較少。

1.6 超臨界CO2流體萃取法

超臨界流體指處于臨界溫度和臨界壓力以上的流體。CO2由于適中的臨界條件、無毒、無燃爆危險等優點成為最常用的超臨界流體[24]。超臨界流體萃取(Supercritical fluid extraction，SFE)是利用超臨界條件下的液體作為萃取劑，從液體或固體中萃取出特定成分的技術[25]。

李秋紅等[26]應用超臨界CO2流體提取杜仲葉中總黃酮，通過正交實驗確定最佳工藝為：萃取時間2.5 h、壓力300 MPa、溫度45 ℃、夾帶劑(乙醇)用量3.5 mL·g-1，在此條件下，總黃酮提取率為73.26%、純度為19.82%。麻成金等[27]將超臨界CO2流體萃取應用于杜仲籽油的提取中，并與常規溶劑(石油醚)提取、微波提取進行了比較，認為超臨界CO2流體萃取所得杜仲籽油的品質最優，是提取優質杜仲籽油的首選方法。此外，Li等[28]應用超臨界CO2流體萃取桃葉珊瑚苷也取得了良好效果。

超臨界CO2流體萃取法工藝簡單、效率高，可以在近常溫的條件下提取分離，產物容易進一步分離，對于提取分離脂溶性物質、揮發性成分和高熱敏性物質等有效成分具有獨特的優勢[27,28]。但是該法對設備的要求及能耗相對較高，從而限制了其廣泛應用。

2 分離純化方法

2.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法通常依據相似相溶的原理選擇溶劑，利用物質在兩種不互溶(或微溶)溶劑中溶解度或分配比的不同來達到分離或純化的目的。溶劑萃取法易受到溶劑極性大小、pH值、提取溫度、提取次數、溶劑用量和樣品粒度等多種因素的影響[29]。柳娜等[30]對杜仲中木脂素類化合物純化工藝進行了研究，將溶劑萃取作為初級純化，即先用乙酸乙酯萃取浸提液3次以除去部分雜質，再用正丁醇萃取乙酸乙酯萃余液2次，合并正丁醇的萃取液，減壓蒸餾濃縮再進行后續純化。

近年來發展的雙水相體系萃取在杜仲活性成分的分離純化中也得到了應用，當物質進入雙水相體系后，由于表面性質、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的存在和環境的影響，使其在上、下相中的濃度不同。對于某一物質，只要選擇合適的雙水相體系，控制一定的條件，就可以得到合適的分配系數，從而達到分離純化的目的[31]。彭勝等[32]建立了一種由聚乙二醇與葡聚糖形成的雙水相體系萃取分離杜仲葉中桃葉珊瑚苷的新方法，桃葉珊瑚苷純度達到48.67%，遠遠高于粗提物中的8.75%。

溶劑萃取法具有應用范圍廣、操作簡單、萃取溶劑可以回收再利用的特點，但萃取所得某一相中仍然含有多種性質類似的化合物，更適合杜仲中活性物質的初級分離。

2.2 大孔樹脂色譜法

大孔吸附樹脂具有很大的比表面積，是吸附性和分子篩性原理相結合的分離材料，一方面通過分子間作用力(范德華引力或氫鍵)對被吸附的分子進行吸附;另一方面樹脂具有一定的孔徑，不同分子大小的化合物經過樹脂柱時，又起到一定的分子篩作用，從而達到良好的分離效果[33]。

陳偉[11]通過靜態吸附分離實驗和動態分析篩選出HPD600為純化綠原酸和總黃酮的最優材料。此外，XAD-5和NKA-2型大孔樹脂在杜仲綠原酸的分離中也具有較好的效果[6,34]。曹慧[35]經萃取和吸附除雜后選擇A型大孔吸附樹脂純化杜仲中京尼平苷和京尼平苷酸，總收率分別達到84.15%和73.49%。戚向陽等[36]采用D101型樹脂有效吸附分離杜仲皮中的雙環氧木脂素二糖苷，將上樣液pH值調至10～12,分別用水、30%乙醇進行洗脫，收集30%乙醇洗脫液并進行濃縮和真空干燥，粗提物的產率為1.74%,其松脂醇二葡萄糖苷(PG)和丁香脂醇二葡萄糖苷(SG)含量分別為8.1397%和2.9431%。李輝等[37]用HZ-820型樹脂進行柱層析分離純化桃葉珊瑚苷，重結晶后純度高達96.82%。

大孔樹脂色譜法具有選擇性好、吸附量大、效率高、易洗脫、再生容易和成本低等優點，特別適用于水溶性化合物的分離純化。在杜仲木脂素、環烯醚萜、皂苷、黃酮、綠原酸等的純化中應用廣泛，效果好。

2.3 硅膠色譜法

硅膠色譜法是根據物質在硅膠上的吸附性不同而使物質得到分離，一般情況下極性較大的物質易被硅膠吸附，極性較小的物質不易被硅膠吸附，整個過程就是吸附、解吸、再吸附、再解吸的分離過程[33]。

曹慧等[38]采用硅膠色譜法分離環烯醚萜類化合物，采用干法上硅膠柱，用不同配比的氯仿和甲醇混合液洗脫，同時用高效液相色譜法跟蹤檢測，所得京尼平苷酸和京尼平苷的純度分別達到98.69%和96.54%。柳娜等[30]采用硅膠色譜法同時分離純化杜仲中松脂醇二葡萄糖苷和丁香脂醇二葡萄糖苷，純度分別為90.86%和91.73%。李輝等[39]采用硅膠色譜法從杜仲粕中分離純化桃葉珊瑚苷，經重結晶后可獲純度為96.56%的產品。

硅膠色譜法在杜仲中木脂素類、環烯醚萜類和苷類化合物的分離中應用較廣，一般采用梯度洗脫結合高效液相色譜等先進檢測手段可以得到較純化合物。但是硅膠色譜法周期一般較長，硅膠也不易再生。

2.4 制備型高效液相色譜法

制備型高效液相色譜(PHPLC)克服了傳統的分析型高效液相色譜分離樣品量少的缺點，使產品的分離量達到克數量級及以上，并最終實現了工業化[40]。戚向陽等[36]對樣品進行預處理后，再經PHPLC分離純化和重結晶，得到松脂醇二葡萄糖苷和丁香脂醇二葡萄糖苷白色結晶，純度達到色譜純。彭密軍等[41]采用PHPLC法，以乙醇-水-乙酸為流動相、選用臺階梯度洗脫方式同時制備了京尼平苷酸、京尼平苷、桃葉珊瑚苷等3種環烯醚萜類成分。

制備型高效液相色譜法具有柱效高、分離速度快等特點，是制備純化天然產物和化學合成產物的極好手段，在醫藥工業、生化技術和精細化學品的生產中已有重要的應用[41,42]。但制備型高效液相色譜法只適用于純度較高、成分較單一的一種或幾種物質的純化，對樣品要求較高，否則很難達到良好的分離度。

2.5 其它分離純化方法

凝膠色譜法、制備薄層色譜法、膜過濾和新材料技術在杜仲活性成分的分離純化中也有應用。

凝膠色譜法是根據分子篩效應對不同分子量的化合物實現分離，張玲等[43]以凝膠色譜法從杜仲葉中分離得到4種組分，純度均超過95%，但目前凝膠填料較貴。程德軍等[44]通過兩次制備薄層色譜得到的綠原酸純度超過91.6%，所建立的純化制備方法簡便、直觀，對綠原酸有很好的分離效果，適合于數百毫克級到克級的制備。彭小文[20]以微濾膜和納濾膜處理綠原酸水提液后，有利于后續分離純化。Li等[45]應用新型分離材料分子印跡聚合物對綠原酸進行分離純化，取得了良好效果。

3 結語

綜上所述，杜仲中不同類活性成分提取和分離純化可采用相同的方法，而同一類化合物又可以采用不同方法進行提取和分離純化。為全面開發杜仲活性成分，針對杜仲活性成分提取和分離純化方法，提出如下幾點建議：(1)采用微波或超聲波輔助乙醇進行提取，提取過程中先用低濃度的乙醇，然后定時加入乙醇，逐步增大乙醇濃度，可達到高效充分提取各活性成分的目的。(2)提取液濃縮后采用不同極性有機溶劑依次萃取，進行除雜和初步分離，有利于后續純化。(3)木脂素類、環烯醚萜類和苷類化合物的分離既可以采用大孔樹脂色譜法也可以采用硅膠色譜法，應優先選擇大孔樹脂色譜法。(4)大孔吸附樹脂可同時分離多種化合物，應用乙醇梯度洗脫法，分別收集各梯度洗脫液進行鑒定和后續純化。(5)應用高效液相色譜或者制備型高效液相色譜等現代檢測純化工具，收集相同組分，可達到事半功倍的效果。

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