西侖吉肽的合成制備

孔　毅，黃　海，賴伊麗，黃世龍，劉會敏

(中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009)

西侖吉肽(cilengitide，EMD- 121974)是德國化學家Kessler設計的含有RGD序列的環肽c[RGDf(N-Me)V]。該肽基于體內αvβ3整合素配體，通過綜合運用環化、空間篩選和甲基化掃描而得,對αvβ3整合素具有高親和性和選擇性[1]。臨床試驗表明，該肽不僅能較好抑制黑色素瘤和膠質細胞瘤生長，而且與放射治療配合能提高其他腫瘤如頭頸鱗狀細胞瘤的治愈率[2]，具有較好的市場前景和潛力。

除西侖吉肽發明者提供合成方法外[1]，目前尚未見西侖吉肽合成工藝細節研究的報道。本研究嘗試對西侖吉肽合成方法進行優化，采用Fmoc固相合成與液相合成相結合的方法，以HBTU，PyBOP/HOBt為縮合劑，對合成方法特別是難以縮合的氨基酸的縮合方法進行了研究，對環化條件進行了探索。本方法合成效率高、原料易得、路線簡單易行、具有一定的工業化應用前景。

圖1　西侖吉肽分子結構式[1]Fig.1　The molecular structure of cilengitide[1]

1　材料與方法

1.1　儀器與設備

砂芯玻璃管，4號砂芯；循環水式真空泵，予華SHZ-DⅢ，河南鞏義予華儀器有限公司；紫外-可見分光光度計，752，上海菁華科技儀器有限公司；半制備型高效液相色譜儀，BioLogic DuoFlow Pathfinder 20/80 System，美國Bio-RAD；高效液相色譜儀，島津20A；凍干機，Labconco；質譜儀，島津2010MS。

1.2　材料與試劑

2-CTC樹脂，載量為0.9 mmol/g；9-芴甲氧基羰基(Fmoc)-氨基酸[Fmoc-Arg(Mtr)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-(Otbu-)Asp-OH；Fmoc-D-Phe-OH；Fmoc-(N-Me-)Val-OH]；苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)；六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)；1-羥基苯丙三氮唑(HOBT)；N, N-二異丙基乙胺(DIEA) ；乙二硫醇(EDT)；三異丙基硅烷(TIS)，均為上海吉爾生化公司產品。二氯甲烷(DCM)；無水甲醇；無水乙醇；無水乙醚；三氟乙酸(TFA)；六氫吡啶(哌啶，PIP)；N, N-二甲基甲酰胺(DMF)；茚三酮；均為國產分析純。乙腈，美國TEDIA，色譜純；純凈水，樂百氏牌。

1.3　方法

1.3.1樹脂溶脹

稱取2 g 2-CTC樹脂于燒杯中，用20 mL DMF浸泡30 min后倒出約一半體積DMF，加入10 mL DCM浸泡30 min，用DMF洗滌樹脂2～3次后，用真空泵將樹脂抽濾干。

1.3.2線性肽的合成

1)首個氨基酸上載：稱取Fmoc-Arg(Mtr)-OH 4.16 g溶于10 mLDMF，再加入DIEA 2 mL，溶解完全后與樹脂混合均勻，通氮氣室溫25 ℃下攪拌反應2 h；取少量于EP管中，加20%(體積比)PIP/DMF脫保護5 min，茚三酮法(Kaiser法)[3]定性檢測反應進行的程度，判斷各步接肽的終點，反應結束后，加入2 mL甲醇，繼續反應0.5 h后，抽濾掉反應液后。以DMF洗滌2次后，再以DMF，無水甲醇交替洗滌2次。真空干燥稱重測肽樹脂擔載率，mmol/g。

2)脫保護：加入30 mL 20%PIP/DMF浸沒肽樹脂，氮氣攪拌，分別經過5和15 min的2次脫保護后，茚三酮法檢測，反應完全后抽濾掉反應液，DMF洗滌樹脂3～4次，抽干。

3)上載下一個氨基酸：稱取Fmoc-(N-Me-)Val-OH 1.20 g 溶于適量DMF，再加入HBTU 1.29 g，HOBt 0.5 g，DIEA 1 mL溶解完全后與肽樹脂混合均勻，通氮氣室溫25 ℃下攪拌反應2 h；茚三酮法檢測，反應完全后抽濾掉反應液，DMF洗滌3～4次。Fmoc-(N-Me-)Val-OH為困難氨基酸，單純使用HBTU不能完全縮合，嘗試改用縮合劑PyBOP和延長反應時間來完成縮合。

4)上載其他3個氨基酸：重復2)和3)，把剩下的Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-(Otbu-)Asp-OH和Fmoc-Gly-OH依次接到肽樹脂上。

1.3.3Fmoc法[4]測定連接效率

稱取Fmoc-Gly-OH(相對分子質量：339.4)5 mg置于小玻璃瓶，加1 mL體積分數為20%的PIP/DMF，脫保護30 min，無水甲醇定容至100 mL；再稀釋10倍后， 依次取1、2、3、5、6 和 7 mL置于10 mL容量瓶中，無水甲醇定容，分別與空白即體積分數為20%的PIP/DMF對照，測301 nm的紫外吸收值。利用標準曲線計算肽樹脂的縮合效率。

1.3.4肽樹脂切割與肽沉淀

在樹脂上將線性肽合成完成后，用DMF洗滌3次，甲醇洗滌1次，DMF 洗滌1次，甲醇洗滌1次后真空干燥后，稱重，按1 g肽樹脂5 mL裂解液TFA/DMF(體積比5∶95)的比例加入裂解液，冰浴攪拌反應2 h。然后將裂解液抽濾，并用少量裂解液沖洗樹脂2～3次，沖洗液和裂解液收集到一起。加無水乙醚沉淀得到線性肽粗品，HPLC/MS分析。

1.3.5環肽的合成

線性肽粗品0.85 g溶解于2 000 mL DCM中，加入PyBOP 1.52 g，HOBt 0.4 g，和DIEA 1.2 mL，冰浴攪拌反應24 h。將反應液減壓旋蒸至約20 mL。分別用10%HCl/H2O(體積比)，飽和NaHCO3，飽和NaCl依次萃取后，加入等體積裂解液TFA∶TIS∶EDT∶H2O為95∶2∶2∶1冰浴反應2 h。無水乙醚沉淀得環肽粗品。

1.3.6環肽的分離純化和鑒定

用高效液相色譜(HPLC)分析環肽粗品，液相色譜條件: Kromasil C18(4.6 mm×250 mm) 色譜柱; 波長λ為214 nm; 流動相，A為純凈水∶乙腈∶TFA為90.0∶10.0∶0.1 (體積比)， B為乙腈∶純凈水∶TFA為90.0∶10.0∶0.1 (體積比)；進樣量10 μL; 流速1 mL/min。經MS分析確定主峰與目標肽相對分子質量一致后，用制備型高效液相色譜(HPLC)純化環肽粗品后，冷凍干燥。純化后的環肽用分析HPLC檢測純度，并用質譜與核磁共振研究其結構。

2　結果與分析

2.1　樹脂的選擇

選擇2-CTC樹脂(分子式見圖2, P表示樹脂珠)，因為一方面，與其他樹脂相比，2-CTC樹脂具有很強的活性；氨基酸羧基端與2-CTC樹脂的反應為取代反應，是不可逆反應。另一方面，由于2-CTC樹脂反應位點附近位阻較大，大大減少了二肽時由于分子內環化生成哌嗪二酮(DKP)[5]的可能性。

圖2　二氯樹脂Fig.2　2-CTC resin

2.2　接肽反應

普通氨基酸用HBTU的縮合效率達到95%以上；N-甲基氨基酸屬于困難氨基酸，其反應活性很低，為提高共縮合效率，分別考察HBTU和PyBOP在不同時間2，4，6，8，10 h的縮合效率，結果如圖3。

圖3　HBTU和PyBOP反應進度圖Fig.3　The extent of reaction with HBTU & PyBOP

確定8 h為最適宜反應時間后，考慮到HBTU有一定的縮合效率，而PyBOP雖然縮合效率高但價格較貴，于是采用HBTU和PyBOP以一定比例混合使用，分別以HBTU∶PyBOP(體積比)為1∶2，1∶1，2∶1，3∶1考察縮合效率，試驗結果顯示2∶1為最適宜配比。

2.3　α-氨基保護集基團的脫除

在每一步接肽反應完成后， 下一個氨基酸接入之前， 需要除去保護基團。本次試驗采用的是PIP/DMF的溶液，基團的脫除效果與哌啶的含量及其脫除時間關系見圖4。

圖4　不同濃度哌啶Fmoc脫除率Fig.4　The Fmoc deprotection ratio of piperidine at different concentration

圖4可以看出，隨著哌啶濃度的增加，脫保護率增加且脫保護的時間縮短。使用20%濃度的保護試劑在10 min時脫保護效率可達99%。

2.4　線性肽粗品HPLC和MS結果分析

線性肽粗品HPLC和MS分析結果見圖5和圖6。色譜條件：流動相A為乙腈/水(10%，含0.1 %TFA ，體積分數，下同)，B為乙腈/水(90%，含0.1% TFA)，梯度洗脫0～30 min，20%～40% B。紫外檢測器，波長范圍為214 nm；色譜柱為Kromasil C18，規格為4.6×250 mm，流速為0.2 mL/min。樣品進樣量為10 μL 。

質譜條件：離子檢測方式SCAN，離子極性正離子，離子化方式為電噴霧離子化，檢測電壓1.5 kV，霧化氣體流速1.5 L/min；曲線脫溶劑裝置(CDL)溫度250 ℃，加熱塊(block)溫度200 ℃。

圖5　線性肽粗品HPLC圖Fig.5　The HPLC of the crude linear cilengitide

圖6　線性肽粗品主峰質譜圖Fig.6　The MS of the crude linear cilengitide

2.5　環化方法的選擇

一般環肽按照成環所含鍵分為2類：全部為酰胺鍵的均環肽為一類，除酰胺鍵外還有二硫鍵和醚鍵等的雜環肽為另一類。而按照橋連位置分的話，分為頭尾相連環肽、頭側相連環肽、側側相連環肽。其中頭尾相連合成難度最大，因為線性肽分子趨于能量較低的穩定形態，也就是舒展的狀態。這樣分子的反應位點，即兩端的羧基和氨基空間相距較遠，靠近的可能性較低，反應活性降低。

液相合成環肽，其中發生的反應主要是分子內的反應和分子間的反應。為了減少副反應分子間反應形成的多聚體，應該盡量將肽反應濃度降低，一般控制在10-3～10-4mol/L高度稀釋的溶液里反應。常用的液相合成法有：活潑酯法、疊氮法、混合酸酐法、直接法、硫酯法和輔助成環法[6]。其中活潑酯法、疊氮法和混合酸酐法需要制備中間體，且需要低溫反應。根據實際情況，最終確定使用直接法，反應濃度控制范圍1×10-3～1×10-4mol/L，環化過程用HPLC檢測至反初始應物峰消失。

2.6　環肽粗品的HPLC分析結果

沉淀后得白色環肽粗品560 mg，HPLC分析結果如圖7。

色譜條件：流動相A為乙腈/水(10%，含0.1%TFA，體積分數，下同)，B為乙腈/水(90%，含0.1% TFA) ，梯度洗脫為0～30 min，10%～100% B，紫外檢測器，波長范圍為214 nm；色譜柱為反相C18，規格為4.6×250 mm，流速為0.2 mL/min。樣品進樣量為10 μL 。

圖7　環肽粗品HPLC圖Fig.7　The HPLC of the crude cilengitide

2.7　環肽純化后的HPLC、MS和NMR分析結果

目標峰液體真空冷凍干燥得到189 mg 西侖吉肽，在粗品中質量分數為33.8%；西侖吉肽純度為98.3%，總產率為28.2%(以首個氨基酸上載量1.14 mmol記)。

HPLC結果見圖8，MS結果見圖9。 NMR結果與文獻報道的NMR圖譜[11]一致。

圖8　環肽純化后HPLC圖Fig.8　The HPLC of the purified cilengitide

圖9　環肽純化后質譜圖Fig.9　The MS of the purified cilengitide

3　結論

本研究采用Fmoc固相法合成線性肽，然后采用液相法環化合成了西侖吉肽。合成中，解決了難以縮合氨基酸的縮合效率問題，合成了高純度的線性肽；并選擇合適的液相環化條件合成環肽。所合成環肽純度為98.3%，相對分子質量與理論相對分子質量588相符，NMR圖譜與文獻報道一致，說明該方法合成的西侖吉肽結構正確。本方法合成效率高，原料易得，路線簡單易行，具有一定的工業化應用前景。

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