大豆油脫臭餾出物中角鯊烯的富集研究

丁　輝，程　楠，齊德珍，徐世民

(1.天津大學化工學院，天津 300072； 2.精餾技術國家工程研究中心，天津 300072)

角鯊烯(squalene)，為無色或微黃色透明油狀液體，分子式為C30H50，化學名稱為2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，是一種高度不飽和的直鏈三萜類化合物，廣泛存在于大多數動植物體內。角鯊烯在醫藥、化妝品和保健品等領域有著重要的應用[1-3]。目前它的主要來源為鯊魚肝油，而由于近年來鯊魚的低繁殖率以及環境破壞對魚種的污染，出于對野生海洋動物的保護，提取植物性角鯊烯逐漸替代動物性角鯊烯逐漸成為一種趨勢[4-5]。

大豆油脫臭餾出物(SODD)是大豆油脫臭過程中得到的副產品，主要組成為：游離脂肪酸(FFA)、甘油酯、甾醇及甾醇酯、生育酚、角鯊烯、少量的烴類、酮和醛等。它可用來提取脂肪酸、生育酚、甾醇，也可用于提取角鯊烯。目前國內外對生育酚、植物甾醇的提取分離研究較多，許多成果已經實現工業化[6-9]。

目前植物性角鯊烯的提取分離多采用植物油為原料，價格昂貴，成本較高；主要方法有皂化分離法、減壓蒸餾法、分子蒸餾法、超臨界流體萃取法和柱色譜分離法等[10-14]。本研究以大豆脫臭餾出物為原料，成本低廉，通過皂化、二級分子蒸餾過程富集角鯊烯，用高效液相色譜測定其含量。并討論了皂化反應以及分子蒸餾的最適宜條件，為正在發展的植物角鯊烯的提取提供有用的依據。

1　試驗部分

1.1　儀器與試劑

大豆油脫臭餾出物，ω(角鯊烯)為1.95%，購于某油脂加工廠；色譜純甲醇；液氮；其他為國產分析純。

Waters 600-717-996高效液相色譜儀，美國Waters公司；刮膜式小試分子蒸餾器，德國VTA公司；LABOROTA 4000型旋轉蒸發儀，德國海道爾夫公司；F12再循環冷卻器，德國Julabo公司。

1.2　不皂化物的提取

稱取300 g大豆油脫臭餾出物放入2 000 mL三口圓底燒瓶中，加入一定量的氫氧化鉀-乙醇溶液，在一定溫度下攪拌回流一定時間；停止加熱后用500 mL蒸餾水進行水洗；冷卻后用150 mL正己烷重復萃取5次，合并萃取液；用質量分數為10%的乙醇水溶液洗滌萃取液；將洗滌后的不皂化物在冰箱內存放4 h，將析出的皂去除；用旋轉蒸發儀蒸除正己烷，得到不皂化物[15]。

1.3　分子蒸餾過程

SODD不皂化物從進料器經預熱后進入分子蒸餾裝置，物料在重力及刮膜器共同作用下在蒸發表面上形成均勻液膜，蒸餾溫度由導熱油精確控制。原料在蒸發面上受熱，在高真空條件下(系統壓力低于10 Pa)，低沸點組分從液膜表面蒸發，在中間冷凝器被冷凝成液相，沿冷凝面流入餾出液接收瓶；重組分則沿主體壁面流入餾余液接收瓶。為防止揮發性物質進入真空系統，在管路上設置冷阱，其中加入液氮作為制冷劑。由于真空系統有中間冷凝管和冷阱的雙重冷凝作用，保證了整個系統操作壓力的均衡[15]。

1.4　分析方法

采用Waters 600-717-996 高效液相色譜儀。色譜條件為：色譜柱YMC-PackODS-A(s-5 μm，12 nm)；柱溫25 ℃；流動相V(甲醇)∶V(水)為99∶1，流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；檢測時間25 min；進樣量10 μL。采用面積歸一法計算含量。

2　結果與討論

2.1　皂化反應正交試驗結果

影響皂化反應的主要因素有反應時間、反應溫度和堿的濃度等。以不皂化物中角鯊烯含量為指標，采用L8(27)正交設計對3個因素進行優化，確定最適宜皂化反應條件。其試驗因素和水平設置見表1。水平1的選擇依據為前期單因素試驗結果，水平2則在水平1基礎上相應降低，以尋求在較低時間、較低溫度、較少堿用量的情況下，獲取最適宜試驗效果。試驗結果列于表2中。

表1　皂化反應正交試驗因子水平表Table 1　Definition of factors and levels for saponification

表2　正交設計直觀分析表Table 2　Visual analysis table of orthogonal design

由表2可知，影響皂化反應的因素的主次順序為B>A>C；在交互作用中RB×C>RA×B>RA×C，但是這些交互作用的影響相對于溫度和時間的影響可以忽略不計，可視為由試驗誤差引起的。在此未考慮角鯊烯收率的原因是，在前期單因素試驗結果中，角鯊烯收率變化并不明顯。這是由于維生素E的抗氧化效果甚于角鯊烯，對角鯊烯起到了保護作用，而SODD中維生素E的含量較高，故角鯊烯在原料中具有較高的穩定性，不會遭到破壞，這與文獻報道的結果一致[16]。綜合考慮得出最適宜工藝條件為A1B1C2，即反應時間為40 min，反應溫度為80 ℃，KOH濃度為0.8 mol/L。

為驗證優化條件，取原料10 g，加入0.8 mol/L新配制的氫氧化鉀-乙醇溶液100 mL，在80 ℃攪拌回流條件下反應40 min，按1.2步驟進行提取，在此進行3組平行試驗，3次試驗結果ω(角鯊烯)的平均值為9.9%，收率為98.6%。

2.2　第一級分子蒸餾響應面設計分析

2.2.1設計方案及結果

影響分子蒸餾富集效果的因素主要有：系統壓力、預熱溫度、蒸發溫度、進料速率、刮膜轉速等。由于角鯊烯是熱敏性物質，需盡量降低蒸餾溫度，故固定系統壓力為裝置所能達到的最小壓力，即0.1 Pa，固定預熱溫度70 ℃，SODD進料量60 g。采用Box-Behnken響應曲面法[17]對分子蒸餾效果影響較大的蒸發溫度、進料速率、刮膜轉速這3因素進行試驗設計和分析，以獲得角鯊烯的最高含量及最佳收率。本試驗設計包括12個因子試驗點和3個重復中心點，其中3個重復中心點用來計算純誤差。具體的因素水平見表3。各水平的確定以單因素影響研究結論為依據，由于第一級分子蒸餾的目的是去除輕烴、醛、酮等低沸點物質，而角鯊烯較容易被蒸出，故第一級分子蒸餾在較低蒸發溫度及進料速率范圍內進行。

表3　3因素水平及編碼Table 3　Independent variables and their levels

表4　Box-Behnken試驗設計及試驗數據Table 4　Box-Behnken design and experimental data

2.2.2響應面模型的建立與分析

由Design-Expert軟件對試驗數據進行分析并回歸擬合，方差分析結果如表5所示，可得到以角鯊烯含量及收率為響應值的回歸公式分別為：

表5　角鯊烯含量及收率的響應面分析擬合回歸方程的方差分析結果Table 5　Analysis of variance with regression model on extraction conditions of squalene content and yield

注：Values of “Prob>F” less than 0.050 0 indicate model terms are significant.

Y1=15.01+0.44X1+0.63X1X2-

(1)

Y2=89.00-15.00X1+5.12X2+

(2)

由表5可以看出：回歸方程Y1和Y2的線性相關系數分別為0.965 3及0.980 2；模型項P值均遠小于0.05，說明方程顯著；失擬項不顯著，說明方程的擬合度較好。各交互作用對角鯊烯含量和收率影響的響應面圖如圖1及圖2所示。

圖1　各交互作用對角鯊烯含量影響的響應面圖Fig.1　Response surface curve of squalene content as functions of each interaction

2.2.3最適宜條件的確定及試驗驗證

為使角鯊烯的ω(角鯊烯)和收率同時達到一最適宜值，依舊利用Design-Expert軟件，將ω(角鯊烯)的標準范圍定在15.0%～15.5%，目標選定“maximize”；收率范圍定在90.0%～100.0%，應用2個模型方程，通過Design Expert軟件可以得到目標的圖解最優化。最優化圖解如圖3所示。

最終確定優化條件為：蒸發溫度73 ℃、進料速度1.1 mL/min、刮膜速度250 r/min，此時重相中ω(角鯊烯)為15.2%，收率為92.0%。該溫度條件下能保證角鯊烯不隨之被蒸出，而較低的進料速度可以保證物料在蒸發壁面上的停留時間不致過短，提高蒸發效率；較高的刮膜轉速能使液膜厚度更小，分布更均勻，使得蒸發過程的傳熱和傳質過程更完全，但是轉速過高也會導致角鯊烯在輕組分中出現。

在優化條件下進行重復試驗，試驗結果列于表6中。

表6　最適宜條件下測定結果Table 6　Results in optimal conditions

2.3　第2級分子蒸餾結果分析

以第1級分子蒸餾的餾余物36 g為原料進行第2級分子蒸餾，選用的條件為：系統壓力：0.1 Pa、蒸發溫度175 ℃、進料速率4 mL/min、刮膜轉速200 r/min、預熱溫度：70 ℃、冷凝面溫度：25 ℃。得到ω(角鯊烯)為21.0%的輕相，收率為95.7%。

3　結論

圖2　各交互作用對角鯊烯收率影響的響應面圖Fig.2　Response surface curve of squalene yield as functions of each interaction

圖3　優化圖(覆蓋圖)Fig.3　Overlay plot

采用大豆油脫臭餾出物為原料，探索了經皂化反應及2級分子蒸餾提取植物性角鯊烯代替動物角鯊烯的工藝過程。分別用正交因子設計及響應面法對皂化反應及分子蒸餾的試驗條件進行了優化，得到了相應的優化工藝條件。

1)皂化反應過程：反應時間40 min，反應溫度80 ℃，KOH濃度0.8 mol/L，得到ω(角鯊烯)為9.92%的不皂化物，收率為98.6%；

2)第1級分子蒸餾過程：蒸發溫度73 ℃，進料速率1.10 mL/min，刮膜轉速250 r/min，得到ω(角鯊烯)為15.2%的重相，收率為91.7%。經第2級分子蒸餾過程得到ω(角鯊烯)為21.01%的輕相，總收率為86.8%。

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