酶聯免疫吸附法檢測HBsAg結果的影響因素探討

王一丁

（遂寧市中醫院檢驗科，四川遂寧629000）

酶聯免疫吸附法檢測HBsAg結果的影響因素探討

王一丁

（遂寧市中醫院檢驗科，四川遂寧629000）

目的探討不同因素對酶聯免疫吸附法檢測HBsAg結果的影響。方法采用同一批次的試劑對不同狀態的血清標本進行同步檢測，對結果進行比較分析。結果A組(不抗凝血液標本)HBsAg陽性檢出率分別為44.4%、11.1%和0%。B組(抗凝劑血液標本)HBsAg陽性檢出率分別為0%、33.3%和0%。C組(含血細胞標本)HBsAg陽性檢出率分別為22.2%、66.7%和100%。結論引起結果有誤的原因有外源性和內源性，其中最主要的是標本有溶血或者渾濁現象。為了最大限度地減少誤差的發生，要對血清標本的不同情況采取相應的處理。

酶聯免疫吸附測試；乙型肝炎表面抗原；影響因素

乙型肝炎表面抗原（HBsAg）是病毒HBV在肝細胞內表達的產物，也是人體感染乙肝病毒后首先出現的血清標志物[1]。HBsAg陽性可見于急性乙型肝炎患者潛伏期、急性感染期、慢性乙型肝炎、無癥狀HBsAgHBV攜帶者。因此HBsAg是乙型肝炎的主要感染指標之一。在臨床上，酶聯免疫吸附法（ELISA）因其靈敏度高、特異性強等優點而在HBsAg檢測中被廣泛應用。但是實際上在用此法檢測HBsAg時常常會出現假陽性、假陰性及重復性不好的現象[2]。尤其是假陽性檢查結果往往會給體檢人群帶來巨大的思想負擔，容易引發對醫療人員的投訴，造成不必要的麻煩[3]。針對此類現象，筆者現采用同一批次試劑對不同的血清標本進行重復檢測，以分析影響HBsAg檢測結果的因素，使其假陽性率更低，結果更加準確，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 一般材料選取我院2010年7月至2011年7月27例體檢人群做乙肝兩對半的靜脈血血清標本81份。采用上海科華生物工程股份有限公司生產的乙肝酶聯免疫HBsAg診斷酶聯免疫試劑盒及Anthos1010酶標儀和Anthos Fluido洗板機。

1.2 方法分組與檢測方法嚴格按照試劑和儀器說明書里的內容操作。在吸取血清的過程中要小心，避免人為破壞性因素[4]。將27例健康人血液標本分別取3管，平均分為A、B、C 3組，共81份標本。A組27份為不抗凝血液標本，分為3小組，每組9例，分別靜置0.5 h、1 h和2 h后，靜置后離心15 min，取出血清分別檢測HBsAg。B組27份為加抗凝劑血液標本，平均分為3組，每組各9例，分別裝入不抗凝管、肝素鈉抗凝管和枸櫞酸那鈉抗凝管，其中不抗凝管靜置2 h后離心，再靜置15 min。C組27份為含血細胞標本，抽取其中健康人血液標本，取0.2 ml血細胞和1.2 ml血清稀釋成含有不同濃度血細胞的標本，檢測HBsAg含量。

2 結果

2.1 A組A組不抗凝標本中，凝血0.5 h、1 h、2 h的HBsAg陽性檢出率分別為44.4%(4/9)、11.1%（1/9）和0（0/9）。

2.2 B組B組分別裝入不抗凝管、肝素鈉抗凝管和枸櫞酸那鈉抗凝管的HBsAg陽性檢出率分別為0%(0/9)、33.3%（3/9）和0%(0/9)。

2.3 C組C組中隨著血細胞濃度的增高，HBsAg陽性檢出率也隨之增高，分別為22.2%（2/9）、66.7%（6/9）和100%（9/9）。

3 討論

體檢時，血液中心和血站對供血者健康檢查中要求HBsAg為陰性，因此HBsAg的結果是否準確有著至關重要的意義。最常用的ELISA標本是血清，而血漿和血清的不同之處在于前者含有纖維蛋白原和抗凝劑，一般檢驗中均以血清作為檢測的標本。ELISA一步法檢測乙肝兩對半可以使操作步驟簡化，縮短檢驗時間，同時應用高親和力的單克隆抗體或者高純度的抗原可以顯著提高檢測的特異性和敏感性[5]。

3.1 結果分析本研究中A組為不抗凝血液標本組，結果顯示，在血液自我凝固時間為0.5 h和1 h就強行分離血清檢測HbsAg的假陽性率為44.4%和11.1%。有時候體檢人員為了節省時間快速檢測，經常會在血液還沒有開始凝固的時候就強行分離血清，這樣很容易造成假陽性的結果誤導。若體檢者在次日復查同一指標，完全可以因為血液已經完全凝固，血清中不含有纖維蛋白原而檢測出陰性的結果。而血清分離不徹底的原因還會有以下一些情況：1）血清中殘留有部分纖維蛋白原，容易附著在反應孔壁或者在氣孔凝集，兩種情況都可以將酶結合物吸附在反應孔中無法洗滌干凈，因而產生假陽性結果[6]。2）纖維蛋白原反應的微環境發生改變，會降低檢驗的靈敏度，從而產生假陰性。B組為加入抗凝劑的標本，結果顯示，肝素鈉抗凝管中HBsAg出現33.3%的假陽性后果，可能原因是由于各種人為因素引起標本溶血，使紅細胞產生溶解，細胞內的過氧化物酶進入血漿，并大量吸附于細胞碎片及纖維蛋白原上，增加了加樣后微孔的洗滌難度，同時抗凝劑在抗凝過程中合成了結合物，使ELISA系統中的過氧化物酶顯色出現異常，使結果不一致[7]。因此在工作人員采血時系帶時間不要過久，抽血時放慢速度，同時保存處理好標本，防止溶血。C組為含有血細胞的標本。大多情況下血清為帶血細胞標本，而其中紅細胞里的亞鐵血紅素具有過氧化物酶的活性，如果反應孔因為非特異性吸附紅細胞，加入底物后產生顯色反應，就會產生假陽性后結果。隨著血細胞濃度的升高，假陽性的比例也在上升。

3.2 試劑的選擇隨著科學技術的不斷發展，肝炎標志物的檢驗方法也在不斷更新提高。各生產廠家生產的酶聯免疫吸附試劑盒在很大程度上方便了基層單位開展日常工作。然而，即使是同一試劑盒，不同廠家生產的試劑靈敏度與特異性均存在一定差別。有的廠家酶標板孔間A值差甚至大于15%，標記酶的活性及顯色液的穩定性不好。使用劣質試劑必然使結果的錯誤率上升。因此應該選擇高質量的試劑盒，從外源性因素上最大程度地降低錯誤率[8]。

3.3 標本因素的影響標本污染：標本受到細菌的污染，菌體內可能含有辣根過氧化物酶，容易產生非特異性顯色，出現假陽性；標本放置時間過久：在冰箱中存放過久的標本，其血清IgG可聚合為多聚體，甲胎蛋白可以形成二聚體，在ELISA測定中會造成假陽性[9]。若采血后不在當天檢測，標本應放在2℃～8℃的冰箱里保存。標本若需儲存較長時間，則應吸出血清放在-20℃的冰箱內保存[10]。

3.4 操作因素工作人員在加樣時應使用一次性吸嘴，避免交叉污染。加樣品、酶結合物和底物時都應該將所加物質加在ELISA板孔的底部，不應加在孔壁上部，而且要注意不可以濺出和產生氣泡，否則也會影響結果的準確性[11]。在人工操作時，加樣板過多會造成加樣后放入孵箱前等待時間過久，或孵育時沒有加蓋，使標本蒸發吸附在孔壁上，或者人為延長孵育時間，使非特異性結合緊附在反應孔周圍不好易徹底清洗干凈，造成假陽性。所以在加樣后要及時放入孵箱，標本數量過多時要分批操作并加蓋，嚴格按照說明書控制操作時間，最大限度減少假陽性的發生。

3.5 洗滌洗滌在此法中雖不是一個反應步驟，但卻對試驗的成功與否至關重要。洗滌時為了洗去反應液中沒有與固態抗原抗體結合的物質以及反應過程中非特異性吸附于固體載體的干擾物。洗滌時的水切勿重復反復利用，避免交叉感染現象的發生。要將留在孔中的殘余酶標記物和血液成分等徹底清洗干凈，避免因清洗不徹底產生誤差[12]。

4 總結

通過以上分析，我們認為在HBsAg檢測過程中注意以下幾點可減少假陽性的發生：1）當天氣寒冷時，應將血液標本應置于浮箱內孵育足夠的時間，待血液標本完全凝固后分離血清；臨床采集的血液標本不要進行強制分離，建議工作人員將采集的標本置于37℃孵箱內保存1～2 h[13]。2）要嚴格避免標本出現溶血現象，血紅蛋白中含有亞鐵血紅素，有類似過氧化物酶的作用活性類似于過氧化物，因此在以辣根過氧化物酶為標記的ELISA測定中，如果血清紅蛋白的濃度過高，很容易在溫育的過程中吸附在ELISA包板聚乙稀板孔，與加入的辣根過氧化物酶底物產生顯色反應，因此在采集標本中要盡量避免溶血。3）血清不能用于肝素鈉抗凝，因為肝素鈉在ELISA測定中會抑制酶的活性[14]。

綜上所述，影響HBsAg檢測結果的因素有很多。為了避免檢測結果出現呈假陽性而誤導工作人員和體檢人員，要求檢驗人員從多方面嚴格控制質量，以期達到最大限度地降低假陽性率。

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Influencing factors of the detection of HBsAg by ELISA.

WANG Yi-ding.Department of Clinical Laboratory, Suining Municipal Hospital of TCM,Suining 629000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo explore the impact of different factors on the detection of HBsAg by Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).MethodsSerum samples of different status were detected synchronously by the same batch of reagents through ELISA.The results were analyzed.ResultsThe positive rate pf HBsAg was 44.4%、11.1%and 0%in group A(blood samples without anticoagulation),0%,33.3% and 0%in group B(blood samples with anticoagulation),22.2%,66.7%and 100%in group C(blood cell samples).ConclusionInaccurate detection results were tend to be caused by exogenous and endogenous factors,mainly hemolysis or turbidity in the specimen.In order to minimize the occurrence of error,appropriate measures should be taken to treat the serum samples according to the individual status of the serum sample.

Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);HBsAg;Influencing factor

R446.61

B

1003—6350（2012）24—103—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.24.044

2012-10-29）

王一丁（1959—），男，四川省遂寧市人，副主任技師，本科。