均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化刺梨多糖的提取工藝

王 慧，黃 聰，杜 薇

(1.中國(guó)人民解放軍第四十四醫(yī)院藥劑科，貴州 貴陽(yáng) 550009；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，貴州 貴陽(yáng) 550002；3.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，貴州 貴陽(yáng) 550002)

刺梨RosaroxburghiiTratt.f.normalisRehd.etWils為薔薇科植物，產(chǎn)于云貴山區(qū)及江浙丘陵地帶，尤其在貴州山區(qū)更為廣見(jiàn)，過(guò)去民間以果實(shí)和根入藥，用于消食健脾、收斂止瀉與解毒[1]。近代研究證明，刺梨汁富含的維生素C、維生素E及超氧化物歧化酶、刺梨多糖和多種微量元素等，具有消除自由基、降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、提高免疫功能等作用[2]。目前對(duì)刺梨多糖提取工藝的研究未見(jiàn)報(bào)道，本課題中使用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)刺梨多糖的提取條件進(jìn)行探討，確定了其最佳提取工藝，為深入進(jìn)行多糖的純化、結(jié)構(gòu)分析、藥理活性等研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為臨床的應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

DU－70型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)貝克曼公司)。刺梨果實(shí)采自貴州貴陽(yáng)、高坡、青巖、貞豐、龍里、凱里、關(guān)嶺孟關(guān)等地，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院董立莎教授鑒定為刺梨 Rosroxburghii Tratt.f.normalis Rehd.etWils的果實(shí)；濃硫酸、苯酚(重蒸)、葡萄糖等均為分析純，水為蒸餾水；苯酚試劑(取苯酚500g，加鋁片0.5g與碳酸氫鈉0.25g，蒸餾收集180℃餾分，稱取此餾分34g，加水500g置棕色瓶中，備用)。

2 方法與結(jié)果

2.1 刺梨多糖含量測(cè)定

2.1.1 溶液制備

精密稱取105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖0.2021g，置250mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.8084g/L葡萄糖溶液，精密吸取溶液7.00mL，用水定容至100mL，得56.59μg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。精密稱取過(guò)40目篩的刺梨粗粉0.2g，各3份，置索氏提取器中，經(jīng)100mL石油醚(60～90℃)回流提取至無(wú)色，藥渣揮干后，再將藥渣用100mL 85%乙醇(90℃)回流提取2 h，以除盡單糖及醇溶性雜質(zhì)，藥渣揮干，置圓底燒瓶中，按均勻試驗(yàn)所得最佳提取條件，即加水25mL，提取3次，每次1 h，合并3次濾液，定容至250mL容量瓶中，即為供試品溶液。

2.1.2 最大吸收波長(zhǎng)選擇

精密量取對(duì)照品溶液，補(bǔ)蒸餾水至2.0mL，按正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)顯色條件，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)做全波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為491 nm。

2.1.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密量取56.59μg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液0.40，0.60，0.90，1.20，1.50，1.80，2.00mL，分別置25mL比色管中，依次加水使最終體積為2.00mL，搖勻，加5%苯酚溶液1mL，濃硫酸5mL，置40℃溫水浴中放置15min，取出放冷，測(cè)定其吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，得回歸方程 A=0.059 1C－0.028 7，r=0.999 3(n=7)。結(jié)果表明，多糖質(zhì)量濃度在2.830～14.150μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取質(zhì)量濃度為56.59μg/mL的對(duì)照品溶液1.30mL 5份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光值。結(jié)果的 RSD值為1.30%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下操作，每隔0.5 h，測(cè)定1次吸光度，共測(cè)定5次。結(jié)果的 RSD為1.51%(n=5)，表明供試品溶液在3 h內(nèi)較穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一樣品5份，每份0.2g，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果的 RSD為2.97%(n=5)。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取同一樣品5份，每份約0.1g，分別精密加入一定量的葡萄糖對(duì)照品，按供試品液溶的制備方法制備溶液，依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 多糖加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.1.4 換算因子確定

精密稱定刺梨多糖16.00mg，置100mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻作為貯備液。精密吸取貯備液0.7mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度 A，從回歸方程中求出供試品溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算換算因子，f=w/(c×d)，測(cè)得 f值為2.089 2，式中 w為多糖質(zhì)量(mg)，c為多糖稀釋液中葡萄糖質(zhì)量濃度(g/L)，d為多糖稀釋因素，f為換算因子。

2.1.5 樣品含量測(cè)定

精密吸取供試品溶液2.00mL，置試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法操作，測(cè)得 A值，從回歸方程中求出供試品溶液中葡萄糖含量，按下式計(jì)算樣品中多糖含量。多糖含量(%)=(c×d×f)/ w×100%，式中，C為供試液中葡萄糖質(zhì)量濃度(g/L)，d為供試液中稀釋因素，f為換算因子，w為供試品質(zhì)量(mg)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地刺梨多糖含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.2 均勻試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)[3－4]及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，考察的因素與水平確定為溶劑量(因素A)、提取時(shí)間(因素B)、提取次數(shù)(因素C)、提取溫度(因素D)及醇沉濃度(因素E)，見(jiàn)表3。采用U6(65)均勻設(shè)計(jì)，以刺梨多糖提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選刺梨多糖回流提取的最佳條件，均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。隨機(jī)安排試驗(yàn)，精密稱取過(guò)40目篩的刺梨粗粉10g，6份，置索氏提取器中，經(jīng)100mL石油醚(60～90℃)回流提取脫脂，藥渣揮干后，再將藥渣用100 mL 85%乙醇(90℃)回流提取2 h，以除盡單糖及醇溶性雜質(zhì)，藥渣揮干溶劑后，按均勻設(shè)計(jì)方案，確定加蒸餾水、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度，合并提取液。減壓濃縮至一半，經(jīng)明膠除鞣質(zhì)，用氯仿和正丁醇(3∶1)多次萃取，除去蛋白質(zhì)，加1%的活性炭脫色2次，抽濾，濾液加入無(wú)水乙醇使乙醇含量達(dá)到試驗(yàn)設(shè)計(jì)所需的量，冰箱靜置24 h。過(guò)濾，殘?jiān)群笥脽o(wú)水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌60℃烘干，即得較純的刺梨多糖。精密稱取刺梨多糖32.30mg，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度，并計(jì)算多糖得率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 U6(65)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2.2.2 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析

將數(shù)據(jù)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行多元回歸分析處理，得回歸方程Y=9.429－0.017A－0.283B+0.378C，其中 S=0.022 7，r=0.999 00，F(xiàn)=492.581，F(xiàn)＞Fɑ，Y的理論預(yù)測(cè)估計(jì)值為 Y= 8.476 7±0.390 8，即 Y值在(7.871 7～9.081 7)%范圍內(nèi)，檢驗(yàn)通過(guò)，回歸方程有意義?；貧w方程及方差分析表明，影響提取效果的因素順序?yàn)镃＞A＞B，即提取次數(shù)、溶劑用量、提取時(shí)間，提取溫度和醇沉濃度幾乎沒(méi)有影響，由直觀分析可知，最佳工藝為A1B1C3，即溶劑(水)用量為50倍，提取時(shí)間為1 h，提取次數(shù)為3次。從試驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)條件考慮，提取溫度為80℃，醇沉濃度為80%。因此，刺梨多糖的最佳提取條件為A1B1C3D1E1。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)優(yōu)選出的最佳提取條件提取刺梨多糖，平行試驗(yàn)3份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度，并計(jì)算多糖得率為8.48%，RSD為1.60%。試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果基本接近，表明該提取條件穩(wěn)定、可行。

3 討論

本試驗(yàn)中采用硫酸－苯酚法測(cè)定刺梨多糖的含量，使刺梨多糖在硫酸作用下先水解成單糖，并迅速脫水，生成糖醛化合物，然后與苯酚合成有色化合物，在491 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。

按均勻設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)條件，明顯減少了多因素試驗(yàn)的試驗(yàn)次數(shù)。對(duì)于刺梨多糖的提取，影響因素最大的是提取次數(shù)，其次是溶劑用量、提取時(shí)間，提取溫度和醇沉濃度幾乎沒(méi)有影響。均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果基本接近，表明該提取條件穩(wěn)定、可行。

從含量測(cè)定結(jié)果可看出，不同產(chǎn)地樣品中刺梨多糖的含量不同，其中關(guān)嶺刺梨多糖含量最高，即24.96%。

[1]趙學(xué)敏[清].本草綱目拾遺[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1983：295.

[2]陳執(zhí)中，陳務(wù)本.民間藥刺梨及其制劑的藥效研究和臨床應(yīng)用[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，1994(8)：20.

[3]董鈺明，唐興文，張樹(shù)江，等.紅毛五加多糖的含量測(cè)定條件和提取工藝優(yōu)選[J].中南藥學(xué)，2006，4(2)：86－88.

[4]杜清等.明黨參多糖提取工藝研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2005，19(4)：51.