真核肽鏈釋放因子eRF3b在人肝組織及體外肝細(xì)胞中的表達(dá)

李 曼，賈 媛，員美娜，劉志鵬，劉殿武

（河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，河北石家莊 050017）

·研究快報(bào)·

真核肽鏈釋放因子eRF3b在人肝組織及體外肝細(xì)胞中的表達(dá)

李 曼，賈 媛，員美娜，劉志鵬，劉殿武*

（河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，河北石家莊 050017）

肝細(xì)胞；真核細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

在真核細(xì)胞中，真核釋放因子eRF3有許多功能，它控制調(diào)節(jié)細(xì)胞周期由G1期到S期的轉(zhuǎn)相［1］，在翻譯終止過程中以GTP依賴的形式調(diào)節(jié)蛋白的合成［2］等，本室前期利用飛行質(zhì)譜檢測到乙型肝炎病毒相關(guān)肝病中存在著差異蛋白真核肽鏈釋放因子3b（eukaryotic peptide chain release-factor GTP-bind subunit，eRF3b），本研究對(duì)其在不同組織細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行分析，旨在為其作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織來源：河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外科手術(shù)切除的肝癌4例，并取癌旁組織4例作為對(duì)照。石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色；細(xì)胞來源，QSG-7701（正常人肝細(xì)胞），HepG2（人肝癌細(xì)胞），HepG2.215（乙型肝炎病毒感染的人肝癌細(xì)胞），10%胎牛血清培養(yǎng)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2 Real time RT-PCR：引物由NCBI-Primer 3.0設(shè)計(jì)，上海生工生物工程公司合成。應(yīng)用Quant One Step qRT-PCR（SYBR Green 1）Kit于20μL體系內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，儀器為Rotor-GeneTM6000。循環(huán)條件為，50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95℃預(yù)變性2 min，94℃變性20s，68℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3 Wstern Blot：細(xì)胞總蛋白上樣量60μg，20mA恒流2h；切膠后進(jìn)行干轉(zhuǎn)移1.5h；經(jīng)過封閉，一抗、二抗孵育及洗脫后，遠(yuǎn)紅外成像：奧德賽雙色遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)700 nm通道進(jìn)行掃膜并保存圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SAS 9.3統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，多組均數(shù)的比較采用ANOVA方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測eRF3b蛋白的表達(dá)：4對(duì)肝組織標(biāo)本（癌和癌旁組織）HE染色結(jié)果顯示癌旁組織可見細(xì)胞核圓，細(xì)胞排列整齊。腫瘤細(xì)胞排列凌亂，增生活躍，呈多邊形，核大，核漿比例增大，核分裂相易見。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在4對(duì)組織中，eRF3b的表達(dá)在癌旁組織有2個(gè)為（ +），2個(gè)為（-），在癌組織中，1個(gè)表達(dá)（ ++），有2個(gè)為（+），1個(gè)為（-）。eRF3b/GSPT2蛋白在QSG-7701、HepG2以及HepG2.215內(nèi)也是陽性表達(dá)。

2.2 不同細(xì)胞系基因水平表達(dá)差異：△△Ct相對(duì)定量結(jié)果顯示GSPT2在各細(xì)胞株的表達(dá)有所差異，在 HepG2細(xì)胞中表達(dá)量高于正常細(xì)胞以及HepG2.215細(xì)胞，而ERF1以及GSPT1在HepG2. 215中表達(dá)量明顯高于其他2種細(xì)胞株。

2.3 不同細(xì)胞系 eRF3b蛋白水平表達(dá)情況：Western Blot檢測可見 eRF3b蛋白特異性條帶，eRF3b/α-tublin的比值，肝癌細(xì)胞珠HepG2的相對(duì)表達(dá)量0.73，QSG-7701和HepG2.215細(xì)胞株分別為0.25及0.24。

3 討 論

本室前期對(duì)乙型肝炎病毒相關(guān)疾病患者血清進(jìn)行質(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量4 210的差異性蛋白片段，在慢性乙型肝炎血清和肝癌血清中差異顯著，后經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜鑒定屬于真核肽鏈釋放因子3b，即eRF3b，所以研究設(shè)想eRF3b是否和肝癌之間存在著某些聯(lián)系。基于此，本研究首先對(duì)eRF3b在肝組織的表達(dá)進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析，因?yàn)橹皇嵌ㄐ苑治鰁RF3b是否在肝組織表達(dá)，研究中僅用了4對(duì)肝癌及癌旁組織，結(jié)果顯示eRF3b在肝組織為陽性表達(dá)。本研究接下來用Western Blot對(duì)eRF3b在不同類型肝細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行測定，結(jié)果可見特異性條帶，相對(duì)分子質(zhì)量位于60 000與94 000之間，大約為83 000，與預(yù)期的相對(duì)分子質(zhì)量68 883有所差別，但與文獻(xiàn)報(bào)道一致［3］。本研究還進(jìn)一步分析了不同肝源細(xì)胞系中eRF3b在mRNA水平及蛋白水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)eRF3b在HepG2的表達(dá)量高于QSG-7701以及HepG2.215，真核肽鏈釋放因子eRF1以及 eRF3a/GSPT1在HepG2.215表達(dá)量最高，在不同類型細(xì)胞中出現(xiàn)的表達(dá)量差異的原因有待進(jìn)一步研究。

［1］ ZHOURAVLEVA G，F(xiàn)ROLOVA L，LE GOFF X，et al.Termination of translation in eukaryotes in governed bytwointeracting polypeptide chain release factors，eRF1 and eRF3［J］.EMBO J，1995，14（16）：4065-4072.

［2］ OZAWA K，MURAKAMI Y，EKI T，et al.Mapping of the human GSPT1 gene，a human homolog of the yeast GST1 gene，to chromosomal band 16p13.1［J］.Somat Cell Mol Genet，1992，18（2）：189-194.

［3］ JAKOBSEN CG，SEGAARDTM，JEAN-JEMND，etal. Identification of eRF3b，a human polypeptide chain release factor with eRF3 activity in vitro and in vivo［J］.Molecular Biology，2001，35（4）：575-583.

（本文編輯：劉斯靜）

R575.1

B

1007-3205（2012）09-1091-02

2012-06-27；

2012-08-01

國家自然科學(xué)基金（30972516）；河北省自然科學(xué)基金（C2010000481）；河北省衛(wèi)生廳重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（20090004）

李曼（1977-），女，河北保定人，河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院講師，醫(yī)學(xué)博士，從事肝病分子流行病研究。

*通訊作者。E-mail：liudw56@tom.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.09.041