響應面法優化黑加侖果醋的發酵條件

牛廣財，嚴寶冬，朱 丹，魏文毅，關 琛

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

響應面法優化黑加侖果醋的發酵條件

牛廣財1，嚴寶冬1，朱 丹2，魏文毅1，關 琛1

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

采用響應面分析法(RSM)優化黑加侖果醋發酵的工藝條件。在初始酒精體積分數、pH值、裝液量、搖床轉速4個因素的單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken試驗設計，通過響應面分析，對黑加侖果醋的發酵工藝條件進行優化。結果表明：黑加侖果醋發酵的最佳工藝條件為：初始酒精體積分數5.7%、pH4.5、裝液量97mL/500mL、搖床轉速126r/min，在此條件下的驗證實驗表明，黑加侖果醋的醋酸轉化率為96.78%。黑加侖發酵型果醋呈玫瑰紅色，果香濃郁，酸爽柔和。

黑加侖；果醋；發酵；響應面；優化

黑加侖(Ribes nigrum L.)又名黑豆果，學名黑穗醋栗，屬虎耳草科茶藨子屬，是多年生小灌木，多汁漿果，味酸甜清香。黑加侖富含糖、有機酸以及VC等多種營養成分[1]。大量研究表明，黑加侖具有防癌、改善視力、控制糖尿病、改善血液循環、降血壓、降血脂、改善老年人健忘、行為遲緩等多種保健功能[2-5]。

隨著人們保健意識的加強，果醋的口味及營養越來越受到人們的關注。因此，本實驗以黑加侖果汁為原料，利用自選醋酸菌，并采用響應面分析方法對黑加侖果醋的發酵條件進行優化，從而確定自選醋酸菌的最佳發酵工藝參數，開發出營養健康、風味獨特的黑加侖果醋產品，為其工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養基

AS1.41醋酸桿菌，由黑龍江八一農墾大學食品學院發酵實驗室保藏。

乙酸、乙醇、K2HPO4、氫氧化鈉、殼聚糖等為國產分析純。

活化培養基：麥芽糖1.15g、酵母浸粉1.03g、無水乙酸0.96mL、無水乙醇1.97mL、K2HPO40.22g、蒸餾水100mL，pH4.5。

1.2 儀器與設備

HZQ-QX全溫振蕩器 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；SPH-250型生化培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；BCN-1360型超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器有限公司；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；WS108型手持折光儀 上海測維光電技術有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 黑加侖果酒的制備工藝流程

黑加侖果酒→接種醋酸菌→發酵→澄清→殺菌→灌裝→成品

將黑加侖果汁的糖度調整到22°Bx，以300mL/500mL的裝液量裝入三角瓶中，按體積分數7%的接種量將活化好的酵母菌接種到黑加侖汁里[6]，添加60mg/L的SO2，在24℃條件下發酵7d即得到黑加侖果酒，該果酒酒精體積分數為13.2%[7]。

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 自選醋酸菌的活化

將AS1.41醋酸桿菌接入活化培養基中，在32℃、160r/min的恒溫振蕩培養箱中活化18h。

1.3.2.2 澄清

采用殼聚糖對黑加侖果醋進行澄清處理[8]。

1.3.3 單因素試驗研究

在pH4.5、裝液量100mL/500mL，接種量10%，于32℃、120r/min振蕩培養10d的條件下，考察酒精體積分數：4%、5%、6%、7%、8%對黑加侖果醋發酵的影響；在酒精體積分數5%，裝液量100mL/500mL，接種量10%，于32%、120r/min的振蕩培養10d的條件下，考察初始pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5對黑加侖果醋發酵的影響；在酒精體積分數5%，初始pH4.5，接種量10%，于32℃、120r/min的振蕩培養10d的條件下，考察裝液量(總體積500mL)50、75、100、125、150、175mL對黑加侖果醋發酵的影響；在酒精體積分數5%，初始pH4.5，裝液量100mL/500mL，接種量10%，于32℃振蕩培養發酵10d的條件下，考察搖床轉速60、90、120、150、180r/min對黑加侖果醋發酵的影響。每天記錄其酸度變化，確定合適的發酵條件范圍，以便進一步優化發酵的工藝參數。

1.3.4 響應面法對發酵工藝優化

通過單因素試驗，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，以醋酸轉化率為響應值，設計四因素三水平響應面分析試驗，因素水平編碼見表1。數據用SAS 8.2程序分析確定最優發酵工藝參數[9-10]。

表 1 因素水平方案設計表Table1 Factors and levels of Box-Benhnken experiment design

1.3.5 測定指標及方法

可溶性固形物的測定：采用手持折光儀法；還原糖的測定：采用直接滴定法[11]；酒精度的測定：按GB/T 394.2—2008《酒精通用分析方法》測定；VC的測定：采用2,6-二氯靛酚法；重金屬測定：采用原子吸收分光光度計法[12]。細菌總數的測定：按GB/T 4789.2—2008《食品衛生微生物學檢驗 菌落總數測定》規定方法；大腸菌群的測定：按GB/T 4789.3—2008《食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群計數》規定方法。

產酸量測定[13]：取1mL發酵液，加入50mL蒸餾水，滴入2～4滴0.5%酚酞酒精溶液，用0.1mol/L的NaOH溶液滴定至淺粉紅色。由消耗的NaOH溶液的體積計算樣品中的產酸量(g/L，以醋酸計)，再進一步計算醋酸轉化率。

式中：V1為滴定發酵液樣品耗用的NaOH溶液的體積/mL；V0為滴定加入醋酸菌之前調好的果酒耗用的NaOH溶液的體積/mL；60.05為醋酸的摩爾質量濃度/(g/mol)；c為NaOH溶液的濃度/(mol/L)；V為樣品的體積/mL。

式中：酒精的體積分數轉換成酒精質量濃度(g/L)按1:8比例換算[14]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酒精體積分數對醋酸轉化率的影響

酒精體積分數是影響醋酸發酵的首要因素[15-16]，因此，要對發酵條件進行優化，首先要考慮合適的酒精體積分數。測定在1～10d內不同酒精體積分數對醋酸轉化率的影響，結果如圖1所示。

圖1 酒精體積分數對醋酸轉化率的影響Fig.1 Effect of alcohol volume on vinegar conversion rate

由圖1可知，不同酒精體積分數條件下的醋酸轉化率差異很大，從每個酒精體積分數條件下的最高點來看，酒精體積分數在4%～9%之間時，轉化率隨著酒精體積分數的升高而呈先升高后降低趨勢，當酒精體積分數4%時，發酵到第6天以后，由于發生輕微過氧化現象，轉化率稍有降低。酒精體積分數在8%和9%時的醋酸轉化率一直都很低，所以綜合來看，最適的發酵酒精體積分數選擇在5%～7%之間。

2.1.2 初始pH值對醋酸轉化率的影響

醋酸菌的生長需要一定的p H值范圍，不同的pH值對發酵的影響也很大，合適的底酸質量濃度對醋酸菌的生長繁殖有一定的促進作用[17]。測定1～10d內不同初始pH值對醋酸轉化率的影響，結果見圖2。

圖2 初始pH值對醋酸轉化率的影響Fig.2 Effect of the initial pH on vinegar conversion rate

由圖2可知，不同pH值對醋酸轉化率的影響很大，pH3.5時，由于底酸質量濃度過高抑制了醋酸菌的生長，導致在第6天以后醋酸菌不再繁殖，轉化率幾乎不變，而pH值為5.5時，發酵到第6天以后轉化率急劇下降，出現嚴重的過氧化現象，因此選擇初始pH值在4.0～5.0之間。

2.1.3 裝液量對醋酸轉化率的影響

裝液量的多少直接影響到發酵液溶氧量的多少，也就直接影響到醋酸菌菌體的生長，從而對整個發酵過程產生影響。測定1～10d內不同的裝液量對醋酸轉化率的影響，結果見圖3。

圖3 裝液量對醋酸轉化率的影響Fig.3 Effect of loading volume on vinegar conversion rate

由圖3可以看出，裝液量小時，發酵速度較快，醋酸轉化率高，裝液量增大時，發酵速度相對較慢，當裝液量為150mL/500mL和175mL/500mL時，由于裝液量過大，溶氧量不足，菌體不能夠得到充分的氧氣進行生長代謝，進而影響發酵；而裝液量為50mL/500mL時，過多的溶解氧加速了菌種的繁殖，消耗了發酵液中過多的養分，過多的氧也會抑制代謝，所以在發酵到第7天以后發生過氧化現象，因此選擇裝液量為75mL/500mL～125mL/500mL較適宜。

2.1.4 搖床轉速對醋酸轉化率的影響

搖床的轉速也是直接影響發酵液中溶解氧量的直接條件，因此，測定1～10d內不同的搖床轉速對醋酸轉化率的影響，結果見圖4。

圖4 搖床轉速對醋酸轉化率的影響Fig.4 Effect of rotation speed on vinegar conversion rate

由圖4可知，搖床轉速對醋酸轉化率有一定的影響，初期的轉化率較低，搖床轉速在60r/min時，由于溶解氧的不足使得發酵速率一直很低，發酵后期幾乎沒有變化，而搖床轉速在150r/min時，一方面過多的溶解氧使得醋酸菌生長旺盛，耗去發酵液中大量養分，另一方面轉速過大使發酵液中酒精揮發，因此發酵到后期轉化率不斷下降，因此，可以確定最適搖床轉速在90～150r/min之間。

2.2 黑加侖果醋發酵條件的優化

2.2.1 回歸方程建立與方差分析

對表2結果進行回歸分析得二次回歸方程(表3)為：Y＝96.75333-6.039167X1＋0.923333X2-1.384167X3＋2.036667X4-9.525417＋1.8175X2X1-3.461667-1.0875X3X1-0.18X3X2-3.72791+1.6725X4X1-0.2875X4X2+1.26X4X3-3.676667。

如表4所示，一次項、二次項、交互項、總回歸模型的P＜0.01，都是極顯著的；失擬項的F值較小，而P＞0.0 5，不顯著；回歸方程的決定系數R2=0.9805，說明回歸方程的擬和效果較好，各個因素對醋酸轉化率均有顯著的影響。

表2 響應面分析試驗設計及結果Table2 Design and test results of response surface analysis

表3 回歸系數顯著性檢驗表Table3 Significance test table of regression coefficient

為了確定最佳點的值，采用SAS軟件的RSREG程序對實驗模型進行分析，以得到黑加侖果醋發酵的最佳工藝條件，經典型性分析得出最佳發酵條件為：酒精體積分數5.71%、初始pH4.52、裝液量97.18mL/500mL、搖床轉速125.70r/min。該條件下，黑加侖果醋的理論醋酸轉化率預測值為97.92%。

表4 方差分析表Table4 Variance analysis

2.2.2 驗證實驗

為檢驗實驗的可靠性，采用上述最佳發酵條件進行黑加侖果醋的發酵實驗，同時，考慮到實際操作的便利，將最佳條件修正為酒精體積分數5.7%、初始pH4.5、裝液量97mL/500mL、搖床轉速126r/min，經過5次重復實驗，實際得到的黑加侖果醋醋酸轉化率平均值為96.78%，與理論預測值97.92%的相對誤差小于5%，說明該方程與實際情況擬合良好，響應面分析所得到的優化模型是可靠的，表明該數學模型對優化黑加侖果醋發酵工藝條件是可行的，具有實用價值。

3 產品質量指標

3.1 感官指標

黑加侖果醋顏色呈玫瑰紅色，具有濃郁的黑加侖果香；產品口感渾厚，酸爽柔和；澄清透明，無懸浮物及沉淀。

3.2 理化指標

總酸(以醋酸計)：58.0g/L；可溶性固形物：7.0%；還原糖(以葡萄糖計)：2.68g/L；VC：87.0mg/100mL；鉛(以Pb計)：0.16mg/L：砷(以As計)：0.0048mg/L。

3.3 微生物指標

細菌總數＜100CFU/mL；大腸菌群、致病菌：未檢出。

4 結 論

黑加侖果醋最佳的醋酸發酵工藝條件為：初始酒精體積分數5.7%、pH4.5、裝液量97mL/500mL、搖床轉速126r/min，在該條件下，黑加侖果醋醋酸轉化率為96.78%。黑加侖發酵型果醋呈玫瑰紅色，營養豐富，果香濃郁，口感渾厚，酸爽柔和，具有很好的開發前景。

[1]張志東, 李亞東, 吳林, 等. 黑加侖的營養價值[J]. 中國食物與營養價值, 2003(12): 52-54.

[2]張亞樓. 黑加侖營養成分及保健功能研究進展[J]. 國外醫學: 衛生學分冊, 2004, 31(2): 108-111.

[3]TAKATA R, YAMAMOTO R, YANAI T, et al. Immunostimulatory effects of a polysaccharide-rich substance with antitumor activity isolated from black currant(Ribes nigyum L.)[J]. Biosci Biotechnol Bioehem, 2005, 69(11): 2042-2050.

[4]TAHVONEN R L, SCHWAB U S, LINDERBORG K M, et al. Black currant seed oil and fish oil supplements differ in their effects on fatty acid profiles of plasma lipids, and concentrations of serum total and lipoprotein lipids, plasma glucose and insulin[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2005, 16(6): 353-359.

[5]李莉. 新疆黑加侖生物活性有效部位的提取及其功效學研究[D]. 烏魯木齊: 新疆醫科大學, 2008: 15-17.

[6]邸翔, 吾爾妮莎·沙和丁, 宮玉婷, 等. 紅果小檗果醋及其果醋飲料的工藝研究[J]. 食品科學, 2009, 30(12): 300-302.

[7]彭方杰, 牛廣財, 朱丹, 等. 響應面法優化黑加侖果酒發酵條件的研究[J]. 中國釀造, 2010(12): 58-62.

[8]吳國卿, 王文平, 甘紅旗, 等. 野木瓜果醋的澄清研究[J]. 中國釀造, 2011(4): 72-74.

[9]KIM S H. Optimization of fermentation conditions for the manufacturer of wild grape wine[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 2008, 51(1): 24-37.

[10]盧可, 婁永江, 周湘池. 響應面優化楊梅果醋發酵工藝參數研究[J].中國調味品, 2011, 36(2): 57-60.

[11]GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2007.

[12]劉鳳珠, 牛小明, 王穎穎. 果醋中金屬元素的分析[J]. 中國調味品, 2009, 34(5): 101-102.

[13]無錫輕工業學院, 天津輕工業學院. 食品分析[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 1983: 104-106.

[14]鄭弈敬, 李長久, 陳雪珍. 陳醋釀造技術[M]. 太原: 山西科學教育出版社, 1986: 100.

[15]侯愛香. 果醋釀造用優良菌種的選育及果醋飲料的研制[D]. 長沙: 湖南農業大學, 2007: 45-49.

[16]武斌. 山西老陳醋醋酸菌選育與釀造生產工藝研究[D]. 太原: 山西大學, 2007: 24-30.

[17]王麗麗, 儀宏, 沙慧琴, 等. 醋酸菌生長的營養需求及產酸的促進作用研究[J]. 中國調味品, 2004, 29(6): 3-5.

Optimization of Fermentation Conditions for Black Currant Fruit Vinegar by Response Surface Methodology

NIU Guang-cai1，YAN Bao-dong1，ZHU Dan2，WEI Wen-yi1，GUAN Chen1
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China；2. College of Life Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

Response surface methodology was used to optimize fermentation conditions for black currant fruit vinegar. Based on the results of single factor experiments, Box-Behnken experiment design was used to analyze and optimize initial alcohol concentration, pH, ratio of medium volume to shake flask volume and rotational speed. The optimal fermentation conditions were determined as follows: initial alcohol concentration 5.7%, initial pH 4.5, ratio of medium volume to shake flask volume 97:500, and rotational speed 126 r/min. Further validation experiments showed that the conversion rate of acetic acid was 96.78% under the optimal conditions. The black currant fruit vinegar obtained showed red rose color, strong fruity aroma and pleasant soft sour taste.

black currant；fruit vinegar；fermentation；response surface methodology；optimization

TS255.47

A

1002-6630(2012)01-0157-05

2011-09-26

黑龍江省研究生創新科研基金項目(YJSCX2011-263HLJ)

牛廣財(1971—)，男，教授，博士，研究方向為果蔬貯藏加工與發酵食品。E-mail：guangcainiu@yahoo.com.cn