中性植酸酶產生菌的篩選、鑒定及酶學性質

王 陶，李 文，袁佩佩

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221111)

中性植酸酶產生菌的篩選、鑒定及酶學性質

王 陶，李 文，袁佩佩

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221111)

從土壤中分離到一株高產中性植酸酶的菌株，酶活力達12.52U/mL。對其進行形態、生理、生化、分子生物學鑒定，初步鑒定為放射型根瘤桿菌(Agrobacterium radiobacter)。酶學性質研究結果表明：該酶的最適反應溫度為45℃；最適反應pH值為7.0；65℃處理60min酶活力保持80%左右，有一定耐熱性；在pH5.5～8.0之間，穩定性較好；Ba2+對酶活力有一定的激活作用，Fe2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+對酶活力均有一定程度的抑制作用，其中Fe2+的抑制作用最強。

中性植酸酶；篩選；鑒定；酶學性質

植酸酶，即肌醇六磷酸磷酸水解酶，是一類特殊的正磷酸單酯磷酸水解酶，催化植酸水解生成低級肌醇磷酸衍生物和無機磷酸[1]。作為一種新型的飼用酶制劑，它可使植物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷排泄量減少40%[2]，而且能夠通過降低植酸鹽的抗營養作用，增加動物對蛋白質和一些金屬離子的吸收能力[3]。目前，植酸酶已經開始試用在植物性食品中，達到分解植酸磷，平衡營養的作用[4]。植酸酶普遍存在于植物、真菌、酵母和細菌中，其中微生物植酸酶因活性高、生產比較容易等諸多優點，對其研究和開發最為廣泛和深入[5]。

不同來源的植酸酶多種多樣，根據最適pH值的不同，植酸酶可分為酸性植酸酶、中性植酸酶和堿性植酸酶[6]，中性植酸酶主要應用于消化道無胃、腸道呈中性的淡水鯉科魚類飼料[7]，對提高魚類的生長效益、品質及降低飼料中植酸磷對環境的污染有重要意義，近幾年在水產上受到重視[8]。此外，中性植酸酶還可在pH值逐漸升高至中性的單胃畜禽動物腸道中起作用，延長植酸酶在整個動物胃腸道中的作用時間，提高其有效性。目前已分離出多種產中性植酸酶的芽孢桿菌(Bacillus)，主要是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、淀粉液化芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)及其他菌株(Bacillus sp.)等[9]。本研究擬從自然界的土壤中篩選出新的產中性植酸酶的菌株，并研究其酶學性質，以期進一步開發產中性植酸酶的微生物資源，為其應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

土樣：采自徐州工程學院附近的農場、樹林、果園等處。

1.2 培養基

平板分離培養基(g/L)：葡萄糖15、植酸鈣5.0、(NH4)2SO43、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5、FeSO4·7H2O 0.1、MnSO4·7H2O 0.1、瓊脂20，pH7.0；斜面培養基(g/L)：NaNO32、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5、FeSO40.01、蔗糖30、瓊脂20，pH7.0；搖瓶產酶培養基(g/L)：葡萄糖15、蛋白胨3、(NH4)2SO42、MgSO4·7H2O 2、KCl 0.5、FeSO40.03、MnSO4·7H2O 0.03，pH7.0。

1.3 菌株的篩選

1.3.1 中性植酸酶產生菌的初篩

稱5.0g土樣于含數粒玻璃珠的45mL無菌生理鹽水中，100r/min搖床上振蕩30min后靜置30min，取上清液原液以及10-1、10-2的稀釋液涂布初篩平板，于(29±1)℃條件下培養3～5d，挑取透明圈直徑與菌落直徑比大的菌落于斜面(29±1)℃培養3～5d。

1.3.2 中性植酸酶產生菌的復篩

菌株接種于錐形瓶中，在(29±1)℃、150r/min培養96h，以4000r/min的速度將發酵液離心10min，上清液為粗酶液，測定粗酶液中植酸酶的活力。

1.4 中性植酸酶活力測定

參照文獻[10]的方法進行。

酶活力單位定義：在溫度37℃、pH7.0條件下，每分鐘從濃度為5.0mmol/L植酸鈉溶液中釋放lμmol無機磷所需的酶量即為一個植酸酶活力單位，以U表示。

1.5 菌種遺傳穩定性檢測

將高產植酸酶菌株連續傳6代，分別搖瓶發酵測酶活力，檢測菌株的遺傳穩定性。

1.6 菌種的初步鑒定

1.6.1 菌株形態學觀察[11]

觀察菌落形態，并于光學顯微鏡下觀察菌體革蘭氏染色、芽孢及鞭毛染色結果。

1.6.2 菌株的生理生化特性鑒定

參照文獻[12-13]的方法進行。

1.6.3 菌株分子生物學鑒定

提取菌株的基因組DNA[14]，根據細菌16S rDNA序列保守性設計通用引物[15]：上游引物5＇-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物：5＇-GGTTACCTTG TTACGACTT-3＇，進行PCR擴增，PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，將測定的序列提交Gene Bank數據庫，使用Blast程序與數據庫中已有的16S rDNA序列進行相似性比較分析，從GeneBank中選擇近緣菌株的16S rDNA序列，應用鄰接法構建系統發育樹，分析該菌株的系統分類地位。

1.7 中性植酸酶粗酶液的酶學性質

1.7.1 酶反應的最適溫度

將粗酶液分別在不同溫度(15、25、35、45、55、60、65、70℃)條件下進行酶促反應，測定酶活力，確定最適溫度。

以最高酶活力為100%，在其他條件下的酶活力占最高酶活力的百分數即為該酶在此條件下的相對酶活力。

1.7.2 酶的熱穩定性

在不同溫度(3 5、45、55、65、70℃)條件下處理粗酶液30min和60min，再在37℃條件下測定酶活力。

1.7.3 酶反應的最適pH值

配制pH值為2.0～7.0的HAc-NaAc緩沖液、pH值為7.5～9.0的Tris-HCl 緩沖液，在上述不同的pH值條件下測定粗酶液的酶活力，確定最適pH值。

1.7.4 酶的pH值穩定性

用不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)的緩沖液在37℃條件下處理酶液30min和60min，然后調回最適pH值，測定剩余的酶活力。

1.7.5 金屬離子和螯合劑對酶活力的影響

在緩沖液中分別添加質量濃度為0.1g/100mL的CaCl2、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、NaCl、KCl、Ba(OH)2、EDTA-Na2，在溫度37℃、pH7.0條件下測定酶活力。

2 結果與分析

2.1 中性植酸酶產生菌的篩選結果

圖1 中性植酸酶產生菌的透明圈Fig.1 Transparent circles of primarily screened strains

在分離的30株菌中篩選出8株菌產中性植酸酶，其中真菌6株，細菌2株。初篩產透明圈情況見圖1。從中選取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株，進行液體發酵，在中性條件下測定粗酶液的酶活力，結果見表1。編號為4的菌株酶活力最高，為12.52U/mL。

表1 各菌株的植酸酶活力Table1 Neutral phytase activity of primarily screened strains

2.2 菌株的遺傳穩定性

對篩選得到的菌株4進行6次傳代，分別測其酶活力，結果如表2，可以看出，該菌株有較好的遺傳穩定性。

表2 菌株的遺傳穩定性Table2 Genetic stability of strain IV

2.3 中性植酸酶產生菌的鑒定

2.3.1 形態特征

菌株4的菌落呈圓形、邊緣整齊、中間隆起、厚實、半透明狀、較為濕潤，經顯微鏡下觀察，該菌為革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛無芽孢。

2.3.2 生理生化特征

表3 菌株4生理生化測定結果Table3 Physiological and biochemical properties of strain IV

從表3可以看出，該菌株最適生長溫度為30℃，最適生長pH值為7.3，該菌株生長無需NaCl，但在1g/100mL的NaCl中生長最好，且可耐受3g/100mL的NaCl。H2S產生實驗、V-P實驗、過氧化氫酶實驗陽性，甲基紅實驗、乙醇氧化成乙酸實驗、淀粉水解實驗陰性。能利用蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、硝酸鈉、磷酸氫二銨。

2.3.3 分子生物學鑒定

圖2 以菌株4的16S rRNA序列為基礎的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequence of strain IV

經測序獲得菌株的16S rDNA序列，長度為1347bp，見圖2。將此序列提交到GeneBank數據庫(登錄號為S000001393)，進行序列比對分析，從數據庫中選擇近緣菌株的16S rRNA基因序列，應用鄰接法構建系統發育樹如圖2所示，進化樹表明菌株4與放射型根瘤桿菌(Agrobacterium radiobacter)親緣關系最近，且在一個分支中。綜合形態特征、生理生化實驗結果以及序列比對結果，確定該菌株為Agrobacterium radiobacter。

2.4 中性植酸酶的酶學性質

2.4.1 酶反應的最適溫度

圖3 溫度對酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity of neutral phytase

如圖3所示，隨著溫度的增加，酶活力呈緩慢上升趨勢，到達45℃時酶活力最高，溫度超過55℃之后酶活力開始迅速下降。可見，酶反應的最適溫度為45℃。

2.4.2 酶的熱穩定性

圖4 酶的熱穩定性Fig.4 Thermal stability of neutral phytase

由圖4可知，中性植酸酶粗酶液具有一定的耐熱性，在45℃處理30min和60min，相對酶活力保持在100%；在55、65℃處理30min和60min，相對酶活力都能保持在80%左右，延長處理時間對酶活力的影響不大，70℃處理后，酶活力損失90%以上。

2.4.3 酶反應的最適pH值

圖5 pH值對酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on the activity of neutral phytase

由圖5可知，酶反應的最適pH值為7.0，且在pH值為6.0～8.0范圍內，相對酶活力都保持在80%以上，此酶活性較高的pH值范圍恰好處在鯉科魚類腸道的pH6.5～8.5范圍內。

2.4.4 酶的pH值穩定性

圖6 酶的pH值穩定性Fig.6 pH stability of neutral phytase

由圖6可知，中性植酸酶在pH5.5～8.0之間，穩定性最好，相對酶活力大于80%，pH值小于3.0和pH值大于8.5時酶活力損失90%以上，隨著時間的延長，酶的pH值穩定性受影響不大。

2.4.5 金屬離子和螯合劑對酶活力的影響

圖7 金屬離子和螯合劑對酶活力的影響Fig.7 Effects of metal ions and chelating agents on the activity of neutral phytase

由圖7可知，Ba2+對酶活力有一定的激活作用，它可能是該酶的激活劑，Fe2+對酶活力有很大的抑制作用，Mg2+、Zn2+和Cu2+對酶活力均具有一定的抑制作用，它們可能是酶的抑制劑，其他離子及EDTA-Na2對酶活力的影響不是很大。

3 結 論

篩選得到一株產中性植酸酶酶活較高的菌株，經形態特征、生理生化特征鑒定及分子生物學鑒定，初步判斷該菌為Agrobacterium radiobacter，目前尚未見Agrobacterium radiobacter產中性植酸酶的報道，且此天然菌株的酶活力水平較高，為12.52U/mL。對此菌株產中性植酸酶粗酶液的酶學性質研究表明：該酶的最適反應溫度為45℃；最適反應pH值為7.0；具有一定的耐熱性，65℃處理30min和60min仍然有80%左右的相對酶活力；在pH5.5～8.0之間，穩定性較好；Ba2+對酶活力有一定的激活作用，Fe2+離子對酶活力有很大的抑制作用，Mg2+、Zn2+和Cu2+對酶活力具有輕微的抑制作用。

目前對植酸酶的研究主要集中在酸性植酸酶上，對中性植酸酶還缺乏系統的研究。本研究獲得產中性植酸酶的新菌株，酶活力水平較高，且有一定的耐熱性，具有潛在的開發利用價值。下一步的工作可從菌株本身和發酵條件兩方面進行改良，進一步提高其酶活力，增大其應用潛力。

[1]MULLANEY E J, DALY C B, ULLAH A H J. Advances in phytase research[J]. Adv Appl Microbiol, 2000, 47: 157-199.

[2]姚斌, 范云六. 植酸酶的分子生物學與基因工程[J]. 生物工程學報, 2000, 16(1): 1-5.

[3]WYSS M, PASAMONTES L, FRIEDLEIN A, et al. Biophysical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphydrolases): molecular size, glycosylation pattern, and engineering of proteolytic resistance[J]. Appl Environ Microbio, 1999, 65(2): 359-366.

[4]董志平, 董立, 馬繼芳. 植酸酶研究進展及應用展望[J]. 河北農業科學, 2003, 7(增刊1): 40-45.

[5]DVORAKOVA J. Phytase: source, preparation and exploitation[J]. Folia Microbiol, 1998, 43(4): 323-338.

[6]MULLANEY E J, ULLAH A H. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 312(1): 179-184.

[7]王翔, 陳代文. 植酸酶的研究與應用[J]. 飼料工業, 2006, 27(14): 20-23.

[8]HUANG Huoqing, SHI Pengjun, WANG Yaru, et al. Diversity of betapropeller phytase genes in the intestinal contents of grass carp provides insight into the release of major phosphorus from phytate in nature[J]. Appl Environ Microbiol, 2009, 75(6): 1508-1516.

[9]付石軍, 孫建義, 高慧, 等. 中性植酸酶及其基因工程研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫, 2005(1): 46-47.

[10]中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所. GB/T 18634—2009飼用植酸酶活性的測定 分光光度法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2009.

[11]黃秀梨, 辛明秀. 微生物學實驗指導[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 2008: 18-29.

[12]布坎南R E, 吉本斯N E. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 8版. 中國科學院生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組, 譯. 北京: 科學出版社, 1984.

[13]李松濤. 食品微生物學檢驗[M]. 北京: 中國計量出版社, 2005: 171-172.

[14]SYN C K C, SWARUP S. A scalable protocol for the isolation of largesized genomic DNA within an hour from several bacteria[J]. Analytical Biochemistry, 2000, 278(1): 86-90.

[15]焦振泉, 劉秀梅, 孟昭赫. 16S rRNA序列同源性分析與細菌系統分類鑒定[J]. 國外醫學: 衛生學分冊, 1998, 25(1): 12-16.

Screening and Identification of a High-Yield Neutral Phytase-Producing Strain and Characterization of Neutral Phytase

WANG Tao，LI Wen，YUAN Pei-pei
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221111, China)

A high-yield neutral phytase-producing strain with an enzymatic activity of 12.52 U/mL was isolated from soil and initially identified as Agrobacterium radiobacter based on its morphological, physiological and biochemical characteristics as and 16S rDNA sequence. The optimum reaction temperature and pH of neutral phytase produced by the strain were 45 ℃ and 7.0, respectively. The relative activity of the enzyme was 80% after heating at 65 ℃ for 60 min, revealing that it was thermostable to some extent. The enzyme was stable at pH values in the range of 5.5-8.0. Its activity could be activated by Ba2+but inhibited by Fe2+, Mg2+, Zn2+and Cu2+.

neutral phytase；screening；identification；enzymatic properties

S816.7；Q933

A

1002-6630(2012)01-0120-05

2011-02-17

江蘇省高校自然科學基礎研究面上項目(10KJD180006)；徐州工程學院科研基金青年課題(XKY2009122)；徐州工程學院科研基金培育課題(XKY2010112)；徐州工程學院大學生創新創業基金項目(201112)

王陶(1976—)，男，副教授，博士，研究方向為離子束生物工程和資源微生物學。E-mail：wangtaohf@126.com