新疆柯爾克孜族傳統發酵飲料博扎中微生物群落結構的PCR-DGGE分析

努爾古麗·熱合曼，華長春，朱曉瑩，古麗蘇木·托克遜，董明盛,*

(1.新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830054；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

新疆柯爾克孜族傳統發酵飲料博扎中微生物群落結構的PCR-DGGE分析

努爾古麗·熱合曼1，華長春2，朱曉瑩1，古麗蘇木·托克遜1，董明盛2,*

(1.新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830054；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

采用PCR-DGGE技術分析新疆柯爾克孜民族古老傳統發酵飲料——博扎(Bozaa)中微生物種群結構，對博扎細菌和酵母菌DGGE圖譜上主要條帶的DNA進行測序和序列分析。結果表明，博扎中細菌組成包括植物乳桿菌(Lactobacterium plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、巴氏醋酸桿菌(Acetobacer pasteurianus)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，初步成功解析評估了博扎中微生物的多樣性。

博扎；變性梯度凝膠電泳；微生物區系

博扎(Bozaa)是一種用小米粉自然發酵而成的發酵飲料，其制作和保藏工藝天然傳統，是一種酒精濃度較低，有CO2殺口感，低糖度，質地濃稠的天然發酵飲料。博扎起源可追述到居住于前奧托曼土耳其的古老名族，作為一種健康飲品延續至今，不僅在其原產地仍然盛行，也已經廣泛傳播至美洲、亞洲等地區，至今只有在我國新疆部分地區的柯爾克孜族家庭保留著制作和飲用博扎的習慣。作為傳統自然發酵食品，獨特的發酵方式決定了其中微生物區系的多樣性，其中微生物菌系十分復雜，蘊藏著豐富的微生物資源，也是優良益生菌的來源。但有關新疆柯爾克孜族傳統發酵飲料及其中的益生菌至今處在瀕危狀態，有關博扎的研究可以說還屬于空白，國內外未見關研究報道。因此，本研究可以說是在工業化時代，對古老傳統發酵飲料博扎中的微生物組分的挽救工作。

近年來，基于16S rDNA的分子生物學技術結合變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)為有效分析復雜微生物群落及其多樣性提供了一種先進手段[1]。本研究采用PCR-DGGE指紋技術，解析博扎中微生物種群結構，揭示其中優勢菌群組成，以為確定博扎飲料發酵優勢微生物組分提供科學線索的同時，為進一步研究博扎的發酵機制、其質量控制以及此類發酵飲料今后的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

博扎樣品均采自新疆維吾爾自治區阿克蘇溫宿縣柯爾克孜族家庭，自然發酵1d后放置冰盒內空運到實驗室，并在第2天處理樣品。

DNA提取試劑盒、PCR-supermix試劑 天根生化科技(北京)有限公司；DGGE試劑 美國Sigma公司；引物 上海生工生物工程技術服務有限責任公司合成。

1.2 儀器與設備

MyCycler梯度PCR 儀、Bio-Rad Dcode System 美國Bio-Rad公司；CDS8000凝膠成像分析系統 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA的提取

用細菌基因組DNA提取試劑盒及酵母菌基因組提取試劑盒從博扎樣品中直接提取細菌總DNA和酵母總DNA。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20℃冰箱保存備用。

1.3.2 PCR-DGGE分析

1.3.2.1 PCR擴增

細菌PCR擴增對象為細菌16S rDNA V6～V8可變區：上游引物為UGC 968- F(5＇-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA GGG GAA CGCGAA GAA CCT TAC-3＇)，下游引物為L1401R(5＇-GCG TGT GTA CAA GAC CC-3＇)[1-2]。酵母菌PCR擴增對象為酵母菌26S rDNA的D1區；上游引物為NL1GC-f(5＇-GCG GGC CGC GCG ACC GCC GGG ACG CGC GAG CCG GCG GCG GGC CAT ATC AAT AAG CGG AGG AAA AG-3＇)，下游引物為LS2(5′-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3＇)[3-4]。

PCR 反應體系(50μL)：模板DNA 2μL，1×PCR緩沖液，0.2mmol/L dNTP，引物均為0.5μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.25U，補充ddH2O至終體積50μL[3,5]。

PCR擴增采用梯度PCR儀。PCR條件采用降落PCR，反應程序為：94℃預變性4min，先20個循環(94℃ 變性30s，退火溫度65～55℃，每個循環降低0.5℃，退火30s，72℃延伸30s)，再于恒定退火溫度條件下進行10個循環(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，最終72℃延伸10min。PCR 產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20℃冰箱保存備用[6]。

1.3.2.2 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

8%聚丙烯酰胺凝膠 (丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺體積比37.5:1)。變性梯度從40%到60%(100%變性劑含有7mol/L 尿素和40%甲酰胺)，在1×TAE 緩沖液中，先200V 預電泳5～10min，然后在85V 的固定電壓條件下電泳12～14h[7-8]。

1.3.2.3 染色(銀染和EB染色)

銀染是在電泳完成后將膠取出先置于一個干凈的不銹鋼或塑料容器中，加入200mL固定液，搖3 min；將固定液倒在容器中(后面操作使用)；添加200mL銀染溶液，搖10min；棄去銀染溶液，用蒸餾水輕洗膠和容器；添加新鮮蒸餾水，搖2min；棄去蒸餾水，加顯影溶液，直至出現清晰條帶為止，結束顯影，棄去顯影溶液。加入使用過的固定液，搖5min；棄去固定液，加入蒸餾水，搖2min，棄去蒸餾水；加入保存溶液，搖7min；銀染后用凝膠成像系統進行照相。圖像用Quantity one分析軟件進行分析[8-9]。

EB染色是在將DGGE膠在1×TAE(含0.5mg/L EB)中浸泡15min，棄去浸泡液，再在ddH2O中浸泡20min。然后用凝膠成像系統進行照相[9]。

1.3.2.4 DNA條帶的回收

將EB染色的DGGE膠置于紫外燈下，切下不同位置的條帶，將凝膠條剪成許多細小片，將碎片分別轉移入1.5mL 離心管中；用洗脫緩沖液覆蓋凝膠碎片并于37℃溫育過夜；室溫6000r/min離心10min，以沉淀凝膠碎片；移出上清液，注意不要混有聚丙烯酰胺碎片，另用洗脫緩沖液洗滌聚丙烯酰胺凝膠碎片，回收殘存的DNA，必要時再離心，合并兩次上清液；DNA用兩倍體積100%乙醇沉淀，-20℃冷凍30min，12000r/min離心10min，DNA沉淀以100μL TE緩沖液重新溶解。往DNA溶液中加入10μL 3mol/L pH5.2的乙酸鈉、兩倍體積100%乙醇，重復沉淀過程，12000r/min離心10min回收DNA；沉淀物用70%乙醇洗滌、干燥、用TE緩沖液重新溶解[10]。

1.3.2.5 測序及相似性分析

以回收DNA為模板，進行PCR 擴增，細菌引物為：上游引物968- F(5＇-AAC GCG AAG AAC CTT AC-3＇)，下游引物L 1401R(5＇-GCG TGT GTA CAA GAC CC- 3＇)；酵母菌引物為：NL1(5＇-GCC ATA TCA ATA AGC GGA GGA AAA G -3＇)和LS2(5＇-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3＇)。

擴增程序：94℃預變性4min，30個循環(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，最終72℃延伸10min。細菌16S rDNA V6～V8可變區和酵母菌的26S rDNA的D1區PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果采用EditSeq程序進行拼接。登陸NCBI(www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/)網站，將所得序列與數據庫中已知序列進行比較。用Clustal1.83 和Mega 軟件進行相似性分析及構建系統發育樹，確定分類地位并將序列提交到GenBank核酸序列數據庫得到登陸號[11]。

2 結果與分析

2.1 博扎中細菌種群結構的PCR-DGGE圖譜分析

以提取的博扎中細菌總DNA為模板，用16S rDNA的V6～V8可變區引物(帶GC夾)進行PCR擴增，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所有樣品都檢測到大小約為440bp的特異性擴增片段，結果表明本實驗采用的DNA提取方法及PCR擴增條件是合適的(圖1)；用26S rDNA的D1 區引物(帶GC 夾)進行PCR 擴增，獲得300bp 的特異性擴增片段(圖2)。

圖 1 博扎中細菌16S rDNA V6～V8可變區PCR擴增產物電泳圖Fig.1 PCR amplification products of 16S rDNA V6-CV8 fragments from Bozaa

圖2 博扎中酵母菌26S rDNA D1區PCR 擴增產物電泳圖Fig.2 PCR amplification products of yeast 26S rDNA D1 fragments from Bozaa

分別對得到反映博扎中細菌的16S rDNA V6～V8區擴增產物和酵母菌26S rDNA D1區擴增產物進行DGGE電泳檢測，分別得到反映博扎中細菌種群結構的DGGE指紋圖(圖3)和反映博扎中酵母菌種群結構的DGGE指紋圖(圖4)。

圖3 博扎中細菌菌落PCR-DGGE指紋圖譜菌相分析Fig.3 DGGE fingerprinting of bacterial communities in Bozaa

圖4 博扎中酵母菌落PCR-DGGE指紋圖譜菌相分析Fig.4 DGGE fingerprinting of yeast communities in Bozaa

從圖3可以看出，細菌圖譜中出現4條條帶；從圖4可以看出，酵母菌圖譜中出現1條條帶，在空白對照泳道中沒有出現條帶，說明出現的條帶可以特異性代表博扎微生物種屬。

2.2 割膠回收條帶及其分子比對

將純化DGGE膠上的DNA條帶，并對此片段擴增、測序，經過Blast程序比對，確定條帶A的序列與巴氏醋酸桿菌相似性達99%，條帶B與植物乳桿菌相似性達99%，條帶C與蠟狀芽孢桿菌相似性達99%，條帶D與短乳桿菌相似性達99%，條帶I與啤酒酵母菌相似性達99%。本實驗所測得的條帶序列都已被GenBank數據庫收錄，其登錄號見表1。

表1 博扎中細菌和酵母菌序列分析Table1 Results of sequence analysis of bacterial and yeast communities in Bozaa

3 討 論

博扎主要產地為中亞、中東和非洲地區部分國家，作為一種傳統發酵飲品，其發酵過程中的微生物構成復雜。國外有文獻報道對產自土耳其等國家的博扎中的微生物采用傳統方法分離與鑒定，從研究結果來看，其中蘊藏著豐富的對人體具有益生作用的特殊微生物資源，包括乳酸菌及酵母菌。在博扎飲料微生物組分研究方面，由于在國內，除了小米發酵飲料及酒方面有些研究報道，但與其制作工藝及風味等方面有一定的區別[12]。

在國外，關于博扎飲料微生物組成及其優勢菌的分離鑒定方面有研究報道。Botes等[13]學者對土耳其發酵飲料博扎樣品微生物組成研究表明，Lactobacillusparacasei subsp. paracasei、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus rhamnosus 和Lactobacillus fermentum等乳酸菌和Candida diversa、Candida inconspicua、Candida pararugosa、Issatchenkia orientalis、Pichia fermentans、Pichia guillliermondii、Pichia norvegensis、Rhodotorula mucilaginosa 和Torulaspora delbrueckii 等酵母菌參與博扎的發酵過程。

本研究結果初步得到新疆柯爾克孜族家庭博扎飲料中微生物組成包括：植物乳桿菌(Lactobacterium plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、巴氏醋酸桿菌(Acetobacer pasteurianus)和蠟狀芽孢桿菌(B a c i l l u s c e r e u s)等細菌；酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。此研究結果與之前國外學者相關研究結果也有共同點，植物乳桿菌(Lactobacterium plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)等菌不同地區博扎飲料中普遍存在；但是新疆柯爾克孜族家庭博扎中分離得到的巴氏醋酸桿菌(Acetobacer pasteurianus)和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)在以前的研究結果中未發現。此外關于酵母菌的結果也有不同之處，本研究結果中酵母菌發現釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，這可能與本研究樣品的數量有關，應該進一步對來自不同環境、不同家庭里發酵的博扎飲品作為材料進一步研究比較其中的優勢菌，找出相對穩定的優勢菌群。

從以上研究結果可見，不同國家、同一國家不同地區以及同一地區不同家庭發酵的博扎中的微生物組成有一定的差異，因此其風味也有所差異。這說明不同來源的博扎，因為地區差異、工藝及制作環境等方面不同等原因，其中微生物的種群結構具有一定差異，此外也可以說是不同研究方法所得到的結果差異，因此用分子生物學方法[16]解析其中所含的細菌及酵母菌對分離純化發酵過程中優勢微生物具有指導作用并具有更深刻的意義。

[1]ERCOLINI D. PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection of microbes in food[J]. Journal of Microbiological Methods, 2004, 56 (3): 297-314.

[2]ERCOLINI D, FRISSO G, MAURIELLO G, et al. Microbial diversity in natural whey cultures used for the production of Caciocavallo Silano PDO cheese[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 124 (2): 164-170.

[3]COCOLIN L, AGGIO D, MANZANO M. An application of PCRDGGE analysis to profile the yeast populations in raw milk[J]. International Dairy Journal, 2002, 12(5): 407-411.

[4]AILIN B E H, FLEET G H, PRAKITCHAIWATTANA C, et al. Evaluation of molecular methods for the analysis of yeasts in foods and beverages [M]//HOCKING A D, PITT J I, SAMSON R A, et al. Advances in food mycology. USA: Springer Science+Business Media, Inc, 2006: 69-106.

[5]COCOLIN L, INNOCENTE N, BIASUTTI M, et al. The late blowing in cheese: a new molecular approach based on PCR and DGGE to study the microbial ecology of the alteration process[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 90(1): 83-91.

[6]DOLCI P, ALESSANDRIA V, COCOLIN G, et al. Microbiological characterization of artisanal Raschera PDO cheese: analysis of its indigenous lactic acid bacteria[J]. Food Microbiology, 2008, 25(2): 392-399.

[7]LEE J S, HEO G Y, LEE J W, et al. Analysis of kimchi microflora using denaturing gradient gel electrophoresis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 102(2): 143-150.

[8]FLOREZ A B, MAYO B. Microbial diversity and succession during the manufacture and ripening of traditional, Spanish, blue-veined Cabrales cheese, as determined by PCR-DGGE[J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 110(2): 165-171.

[9]FASOLI S, MARZOTTO M, RIZZOTTI L, et al. Bacterial composition of commercial probiotic products as evaluated by PCR-DGGE analysis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 82(1): 59-70.

[10]奧斯伯F, 布倫特 R. 精編分子生物學實驗指南[M]. 金友新, 包慧中, 譯. 北京: 中國科技出版社: 31-32.

[11]羅靜初. 生物信息學概論[M]. 北京: 北京大學出版社, 2002: 97-113.

[12]龔院生, 姚艾東, 王成中. 小米發酵飲料的研制[J]. 鄭州糧食學院學報, 1999(3): 41-45.

[13]BOTES A, TODOROV S D, von MOLLENDORFF J W, et al. Identification of lactic acid bacteria and yeast from Bozaa[J]. Process Biochemistry, 2007, 42(2): 267-270.

[14]HANCIOGLU O.., KARAPINAR M. Microflora of Bozaa, a traditional fermented Turkish beverage[J]. International Journal of Food Microbiology, 1997, 35(3): 271-274.

[15]GOTCHEVA V, PANDIELLA S S, ANGELOV A, et al. Microflora identification of the Bulgarian cereal-based fermented beverage Bozaa[J]. Process Biochemistry, 2000, 36(1/2): 127-130.

[16]高蕙文, 呂欣, 董明盛. PCR-DGGE指紋技術在食品微生物研究中的應用[J]. 食品科學, 2005, 26(8): 465-468.

PCR-DGGE Analysis of Microbial Community Structure of Bozaa, a Traditional Kyrgyz Fermented Beverage

Nurgul RAHMAN1，HUA Chang-chun2，ZHU Xiao-ying1，Gulsum TOHSUN1，DONG Ming-sheng2,*

(1.School of Life Sciences, Xinjiang Normal Univery, Urumq 830054, China；2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The microbial community structure of Bozaa, a traditional Kyrgyz fermented beverage, was analyzed by the PCRDGGE technique. PCR amplification of 16S rRNA gene V6-V8 region and 26S rDNA D1 region were performed for bacteria and yeast in the beverage, respectively. The main DNA bands in the DGGE profiles of the PCR products obtained were subjected to sequence analysis. The results showed that the microbial flora of Bozaa was composed of Lactobacterium plantarum, Lactobacillus brevis, Bacillus cereus, Acetobacer pasteurianus, and Saccharomyces cerevisiae, which was a successful primary elucidation of the microbial diversity of Bozaa.

Bozaa；denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)；microflora

TS201.3

A

1002-6630(2012)01-0111-04

2011-08-17

新疆師范大學博士科研啟動基金項目；國家自然科學基金項目(31050005)

努爾古麗·熱合曼(1972—)，女，副教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：nurgul0716@sohu.com

*通信作者：董明盛(1961—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：dongms@njau.edu.cn