極大螺旋藻的硒富集化培養研究

楊瑩瑩，管 斌,*，孔 青，游 泳，高艷艷，張睿欽，李 肖，左 濤，劉進昌，侯慶云

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2. 煙臺欣和企業食品有限公司研發中心，山東 煙臺 264006)

極大螺旋藻的硒富集化培養研究

楊瑩瑩1，管 斌1,*，孔 青1，游 泳1，高艷艷1，張睿欽1，李 肖1，左 濤1，劉進昌2，侯慶云2

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2. 煙臺欣和企業食品有限公司研發中心，山東 煙臺 264006)

為得到大量含有機硒的極大螺旋藻(Spirulina maχima)，以生物量和藻體內硒富集量作為指標，研究不同硒添加量和硒添加方式對極大螺旋藻生長及富硒效果的影響。結果表明，分8d等量(100μL)多次添加100μg/mL Na2SeO3溶液，是最佳添加量和添加方式，可得到生物量為0.903g/L，單位干藻粉有機硒含量為1413.168μg/g的富硒極大螺旋藻。

極大螺旋藻；硒添加量；硒添加方式；生物量；有機硒含量

硒(selenium，Se)是人體必需的微量元素，構成若干抗氧化酶的活性中心，可影響機體抗氧化能力和對相關疾病的抵抗能力，具有重要的生理功能和廣泛的藥理作用[1]。而螺旋藻(Spirulina)中含有極為豐富的營養成分和多種生物活性物質，硒與螺旋藻結合產生富硒螺旋藻。富硒螺旋藻在醫藥和營養保健品開發方面已顯示出了應用價值[2-4]。在培養液中添加亞硒酸鈉可以實現螺旋藻對硒的富集和有機化，而且螺旋藻對無機硒有較強的耐受性，工業化生產技術比較成熟，是對硒進行生物有機化的理想載體[5-6]。本實驗通過無機硒不同添加量和添加方式，研究其對極大螺旋藻生長以及對硒生物富集效果的影響，以期獲得大量的富含有機硒的極大螺旋藻，為后期提取更多含硒藻膽蛋白等創造條件。

1 材料與方法

1.1 藻種與試劑

極大螺旋藻(Spirulina maχima)為中國海洋大學生物工藝實驗室保存藻種。

硒儲備液：1號儲備液：含10mg/mL Se(Ⅳ)的Na2SeO3溶液；2號儲備液：含100mg/mL Se(Ⅳ)的Na2SeO3溶液。亞硒酸鈉、碳酸氫鈉等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-VIS 2802PC型紫外-可見分光光度計 尤尼柯)上海)儀器有限公司；722N型可見分光光度計 上海精密實驗設備有限公司；QHX-250BS-Ⅲ人工氣候箱 上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3培養條件與方法

在250mL三角瓶中加入100mL 優化Zarrouk培養基[7]，用培養6d的螺旋藻(OD560nm約為0.6)作為藻種，接種量10%，在溫度30℃，初始pH值為9.3，光照度3500lx，光照時間24h/d條件下通氣培養，每天定時搖動3次。其中培養條件是根據前期所做的極大螺旋藻培養條件優化實驗所得[7-8]。

1.4 硒的添加方法

1.4.1 不同添加量

為使極大螺旋藻能適應含硒環境，需接種后在無硒環境中生長1d，積累一定的生物量后，自第2天起，連續8d在每天的同一時間，于培養瓶中加入2號硒儲備液，采用等量添加方式，使硒總加入量分別達200、400、600、800、1000、1200、1400、1600μg/mL。每個濃度設2個平行，以不添加硒的螺旋藻作空白對照，培養至10d后收集藻體。培養方法同1.3節，每隔1d，測量560nm處的OD值，繪制生長曲線。收集的藻體用于測定生物量和藻內硒含量。具體添加方法如表1。

表1 等量添加方式下8d內每天加硒量Table1 Selenium addition at the equal daily amounts for 8 consecutive days

1.4.2 不同添加方式

在總加硒量為800μg/mL基礎上，設計5種硒添加方式，每種添加方式設兩個平行。同1.4.1節，各種方式均需在無硒環境中生長至少1d，即最早第2天開始添加硒。第9天所有方式均添加完畢，繼續培養1d，待硒轉化吸收。共培養1 0 d，收集藻體。培養方法同1.3節，每隔1d，測定波長560nm處的OD值，繪制生長曲線。收集的藻體用于測定生物量和藻內硒含量。添加方式如表2所示。

表2 硒添加方式Table2 Selenium addition modes

1.5 極大螺旋藻藻體收集和生物量測定

采用離心法。極大螺旋藻培養至第10天，測定藻液體積。倒入質量恒定的離心管中，5000r/min離心15min，棄去上清液，藻絲體用蒸餾水洗滌，5000r/min離心15min，如法清洗3次。將獲得的藻體置80℃真空干燥箱干燥至質量恒定，記錄數據，經計算即可得生物量。所得干藻粉于4℃冰箱保存，待用。

1.6 硒含量的測定

采用催化硒光度法[9]測定極大螺旋藻中的硒含量。

1.6.1 硒含量標準曲線繪制

分別吸取含硒0.4μg/mL的亞硒酸標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于比色管中，加入0.02mol/L EDTA溶液0. 8mL、0.2mol/L HCl-KCl緩沖液4mL、0.6mol/L KClO3溶液4mL、0.03mol/L 1,8-二羥基萘-3,6-二磺酸4mL、0.03mol/L鹽酸苯肼2mL，加水至25mL，搖勻，在沸水浴中加熱20min，于冷水中冷卻幾分鐘后，用紫外-可見分光光度計于520nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。

1.6.2 極大螺旋藻硒含量測定

1)測總硒：稱取干藻粉0.02g于錐形瓶中，加入混合酸(濃硝酸、高氯酸體積比4:1)15～20mL，加熱至發煙，待溶液變為淡黃色后，再加熱2～3min，此時溶液變為無色，冷卻后定容至100mL，待用。2)測無機硒：取0.02g干藻粉于100mL蒸餾水中，小火微沸30min，過濾得到濾液，定容至100mL，待用。

取適量所得樣品液于比色管中，加入各種試劑，具體步驟同1.6.1節，測520nm處吸光度，通過對照硒含量標準曲線即可求得富硒螺旋藻中的總硒、無機硒含量。總硒含量減去無機硒含量得有機硒含量。定義有機硒比率為有機硒含量與總硒含量的比值，即：

2 結果與分析

2.1 硒添加量對極大螺旋藻生長的影響

當硒質量濃度低于400μg/mL時，能明顯促進極大螺旋藻的生長，在生長前期(前5d)400μg/mL硒的促進作用大于200μg/mL，5d后200μg/mL硒更有利于極大螺旋藻的生長(圖1)。當硒添加質量濃度為200μg/mL時，獲得最大生物量0.678g/L(圖2)。在較低的質量濃度條件下，硒在細胞內參與谷胱甘肽過氧化物酶的合成，它在超氧化物歧化酶的協助下，可有效地清除細胞內的活性氧自由基，延緩衰老，促進藻細胞的生長[10]。當添加量800、1000μg/mL硒時，前期促進了極大螺旋藻生長，而后期抑制作用明顯(圖1)。出現這種情況的原因為：因分多天等量加硒，前期時，培養液中硒含量較低，分別為其添加總量的1/2左右(即第5天時積累量分別為100、200、300、400、500、600、700、800μg/mL)，隨著培養液中硒含量的不斷增加，硒對極大螺旋藻的促進作用變弱，抑制作用變強。實際上，當培養液中硒含量≥300μg/mL時(即總添加量為600μg/mL的第5天)，已開始抑制極大螺旋藻的生長。同時也可以看出，分8d添加硒含量400μg/mL，最終生物量高于未添硒的對照組(圖2)；而4d即添加400μg/mL硒(總添加量為800μg/mL的第5天)時已開始對極大螺旋藻產生強烈抑制作用(圖1)，使生長速率迅速下降。

圖1 不同硒質量濃度條件下極大螺旋藻的生長曲線Fig.1 Growth curve of S. maχima under the environment with various selenium concentrations

圖2 硒添加量對螺旋藻生物量的影響Fig.2 Effect of selenium addition amount on the biomass of S. maχima

更高的硒質量濃度(≥1200μg/mL)將導致極大螺旋藻的生物量及生長速率明顯下降，這可能與高硒對藻的毒性有關[11]。特別地，當硒質量濃度高達1400μg/mL以上時，將導致極大螺旋藻的過早死亡。

本實驗中，多次等量添加硒，總硒添加量≤400μg/mL時，可促進極大螺旋藻生長，而在周志剛等[12]的研究中得出結論：超過60mg/L硒對其藻種產生抑制作用；400mg/L是其藻忍受的最大極限，即致死閾值。該實驗是以一次性加硒作為實驗基礎的，故對螺旋藻的抑制作用明顯。其次，雖然實驗都采用極大螺旋藻，但各實驗室的極大螺旋藻因長期培養、保藏的差異，其生理生化性能也會略有差異，故對硒的耐受性也會不同。從圖1可以看出，總硒添加量為1600μg/mL，第2天開始一次性添加了200μg/mL硒，在第2～3天的生長期內，并沒有對極大螺旋藻產生明顯抑制作用。楊芳等[13]的研究，以一次性加硒為實驗基礎，當硒質量濃度高于1000mg/L時，(極大)螺旋藻的生長完全被抑制甚至死亡；當質量濃度大于320mg/L時對螺旋藻的生長產生明顯抑制，同樣驗證不同極大螺旋藻對硒的耐受程度不同。

楊芳等[14]的另一項研究在極大螺旋藻生長的第5天開始一次性加硒400μg/mL，添加總量最高達1000μg/mL，但對極大螺旋藻的生長抑制作用不是很強，最終生物量仍達0.9g/L以上。余景[5]在極大螺旋藻生長過程中分7d添加硒質量濃度1000μg/mL，對其生長幾乎無影響或有弱的影響，已將高質量濃度硒對螺旋藻生長的抑制作用大幅度降低。這些結果與本實驗數據是有一致性的，同時說明通過對極大螺旋藻藻種和硒添加方式的改進，可以得到較高產量的富硒極大螺旋藻。

研究表明：分多次等量添加硒，硒添加量≤400μg/mL時，可促進極大螺旋藻生長，且前5d高質量濃度硒促進作用較好，后期低質量濃度硒促進作用加強；添加硒質量濃度為800～1000μg/mL時，前期促進生長，后期嚴重抑制生長，且質量濃度愈高，抑制作用愈明顯。硒質量濃度≥1200μg/mL時，在藻生長期一直起抑制作用。

2.2 硒添加量對極大螺旋藻富硒效果的影響

表3 硒添加量對極大螺旋藻富硒的影響Table3 Effect of selenium addition amount on the enrichment of selenium in S. maχima

從表3可以看出，當加硒量為800μg/mL時，單位干藻粉有最高有機硒含量，達971.836μg/g，有機硒比率也達到最高97.44%。硒質量濃度＞800μg/mL時，隨著培養基中硒質量濃度的增加，極大螺旋藻中的總硒含量和有機硒比率逐漸降低，說明極大螺旋藻對硒的富集和轉化具有一定的限度，可能原因為硒的毒性引起藻體對硒的排斥[15]。硒添加量為200μg/mL時，生物量為0.678g/L，有機硒含量為178.711μg/g，培養液中含有機硒量為121.17μg/L；加硒量為800μg/mL時，生物量為0.447g/L，有機硒含量為971.8μg/g，培養液中含有機硒量為434.39μg/L，是前者的3.6倍。因此，添加800μg/mL的硒，雖抑制了極大螺旋藻的生長，但為得到較多的有機硒和質量好的富硒極大螺旋藻，仍選擇此條件作為下一步實驗的基礎。

2.3 硒添加方式對極大螺旋藻生長的影響

圖3 不同硒添加方式下極大螺旋藻的生長曲線Fig.3 Growth curve of S. maχima under the condition with different selenium addition modes

從圖3可看出，在極大螺旋藻生長初期一次性添加硒(實驗組1)會導致藻體死亡，這與鄭文杰等[16]研究中所述一次性加硒質量濃度≥800mg/L時，極大螺旋藻會嚴重中毒死亡，結果一致。而在中間分3次添加(實驗組2)，因一次硒添加量≥250μg/mL，會對螺旋藻產生強烈抑制，添加完后，第8天部分藻體已開始死亡。這與陳填烽等[17]的研究結果出現較大差異。原因主要是因為藻種的不同，鈍頂螺旋藻一般比極大螺旋藻耐硒程度大[14]，在0.02～411.00mg/L質量濃度范圍內硒對(鈍頂)螺旋藻生長有促進作用[18]，有的在552μg/mL條件下仍能正常生長[19]。而極大螺旋藻的一次性添加耐受硒質量濃度低于400μg/mL[12]，故不適合短時間內大量加入硒。

圖4 硒添加方式對極大螺旋藻生長量的影響Fig.4 Effect of selenium addition mode on the biomass of S. maχima

從圖4可以看出，分多次添加比一次性添加和中間加硒有利于極大螺旋藻的生長，等梯度加硒(實驗組4)得到最高生物量1.11g/L，結合等量加硒(實驗組3)和前后段等量加硒(實驗組5)分析，實驗組4前期加硒量較少，在極大螺旋藻生長比較敏感的前期，對其抑制作用較小，從而生物量能較快積累。所有添加方式在添加800μg/mL的前提下，均未能消除對極大螺旋藻生長的抑制作用。

2.4 硒添加方式對富硒效果的影響

因實驗組1嚴重抑制螺旋藻生長，故不考慮此種方式對極大螺旋藻富硒的影響。實驗組2因添加時間較晚，富集硒量較少，且沒有得到很好的轉化。等量添加方式下極大螺旋藻達到最高有機硒含量，且有機硒轉化率最高。可能原因為極大螺旋藻在早期已適應高含量的硒濃度，后期生長的藻的富硒能力較強。結合圖4和表4可以看出，硒對極大螺旋藻生長和富集硒具有不同步性。雖然方式3條件下，極大螺旋藻的生物量不是很高，但與實驗組4、5相差不多，但胞內有機硒含量有較大的優勢，為得到優質的高富硒量的極大螺旋藻，仍然以等量添加作為最好的添加方式。

表4 硒添加方式對極大螺旋藻富硒效果的影響Table4 Effect of selenium addition mode on the enrichment of selenium in S. maχima

3 結 論

極大螺旋藻對硒具有極強的耐受能力和吸收轉化能力，以等量多次添加的形式添加800μg/mL的硒，生物量略有下降，但仍能生長正常，并能獲得較高的總硒及有機硒含量，有機硒轉化率可達95%以上。確定此方法為收獲高質量的富硒極大螺旋藻的最佳條件。該實驗結果與許多文獻[20-23]相比，富硒能力較強，除培養條件略有差別外，主要原因為藻種不同。其次，由于螺旋藻生長特性限制，實驗重復性較差些，致使條件一致時，結果略有不同。可以看出，螺旋藻藻種不同，培養條件不同，會很大程度影響富硒螺旋藻的富硒量和生物量。本實驗未能消除800μg/mL 硒添加量，等量添加方式下硒對極大螺旋藻的抑制作用，可進一步考慮從改良藻種和改變培養條件等方面，提高富硒極大螺旋藻的生物量，為研究富硒螺旋藻的高密度培養以及從中提取含硒活性物質打好基礎。

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Cultivation of Selenium-Enriched Spirulina maχima

YANG Ying-ying1，GUAN Bin1,*，KONG Qing1，YOU Yong1，GAO Yan-yan1，ZHANG Rui-qin1，LI Xiao1，ZUO Tao1，LIU Jin-chang2，HOU Qing-yun2
(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；2. Research and Development Center, Yantai Shinho Food Co. Ltd., Yantai 264006, China)

In order to achieve selenium enrichment in Spirulina maχima, the effects of different amounts and strategies for selenium addition on the growth of S. maχima as indicated by biomass and selenium concentration were explored. The addition of 100μL of 100 μg/mL Na2SeO3 at the same time each day for 8 consecutive days after 1 day of growth in Se-free environment was found optimal, resulting in a biomass of 0.903g/L and an organic Se content of 1413.168 μg/g dry S . maχima.

Spirulina maχima；selenium addition amount；selenium addition mode；biomass；organic selenium content

TS201.1

A

1002-6630(2012)01-0106-05

2011-01-22

國家自然科學基金項目(31000823)；山東省自然科學基金項目(ZR2010CM050)

楊瑩瑩(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物工程。E-mail：yangyingying923@163.com

*通信作者：管斌(1957—)，男，教授，博士，研究方向為酶工程。E-mail：guanbin@ouc.edu.cn