LTQ-Orbitrap液-質聯用技術對水牛奶酪蛋白的鑒定

王麗娜，徐明芳，成希飛，向明霞，李子超，李昀鍇

(暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632)

LTQ-Orbitrap液-質聯用技術對水牛奶酪蛋白的鑒定

王麗娜，徐明芳*，成希飛，向明霞，李子超，李昀鍇

(暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632)

建立一種快速、高效的分析酪蛋白組分氨基酸序列的LTQ-Orbitrap質譜方法。為了研究水牛奶酪蛋白、乳牛奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白的氨基酸序列組成及氨基酸的替換現象，采用LTQ-Orbitrap液-質聯用技術分別對乳源酪蛋白的4種主要組分進行分析，搜索數據庫獲得4種組分的氨基酸全序列。與水牛奶4種酪蛋白組分進行比對。結果表明，乳牛奶的4種酪蛋白發生氨基酸替換的部位和比率明顯小于山羊奶。這意味著與水牛奶酪蛋白相比，乳牛奶酪蛋白氨基酸的穩定性優于山羊奶酪蛋白。

水牛奶；酪蛋白；氨基酸序列；酪蛋白結構；LTQ-Orbitrap質譜

水牛奶是我國奶業特別是我國南方奶業的一個重要發展方向，其主要營養成分高于荷斯坦乳牛奶，是未來最具市場競爭力的乳品[1]。國內外對水牛奶的研究越來越多，主要是常規營養成分[2-3]、理化性質[4-5]、穩定性[6]、乳蛋白質的組成和特性[7-8]以及蛋白分離分析[9-12]等方面的研究，在水牛奶酪蛋白(casein，CN)組分的肽質指紋譜、氨基酸序列譜等方面的研究則未見報道。

質譜(mass spectrometry，MS)是蛋白質組學研究的關鍵技術，在對蛋白質結構分析的研究中占據了重要地位。蛋白質鑒定是蛋白質組學研究的分支，傳統的鑒定方法有Edman降解法、氨基酸分析法等。Edman降解法測定的肽序列非常準確，但速度較慢，費用較高。氨基酸分析法經濟快速，但靈敏度低[13]。二維線性離子阱高分辨靜電場組合質譜儀(LTQ Orbitrap XL)是目前最先進的質譜儀，它將LTQ與獲得專利的Orbitrap技術整合，具有無可超越的MS和MSn的靈敏度、快速掃描率、高質量精確度和高達100K的分辨能力，并具有新的HCD八極碰撞單元的特性，可以在MS/MS裂解應用中增加靈活性，具有直接從復雜樣品中快速、靈敏、可靠的檢測化合物的能力。LTQ Orbitrap XL質譜可提供蛋白質定量信息，如SILAC、O18等標記定量的蛋白，分析蛋白質的分子質量，氨基酸序列、蛋白質磷酸化位點、差異蛋白比較等信息。

本實驗主要利用LTQ-Orbitrap組合型傅里葉轉換質譜儀對水牛奶酪蛋白的酶解肽段進行質譜分析，檢測各產物肽的相對分子質量，然后在數據庫中檢索，尋找蛋白的氨基酸序列，并與乳牛奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白相對應組分的氨基酸序列比對，研究其氨基酸序列間的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

水牛奶、荷斯坦乳牛奶、山羊奶 市售。

乙腈、碳酸氫銨、三氟乙酸(TFA)、DL-二硫蘇糖醇(DTT)、吲哚-3-乙酸(IAA) 美國Sigma公司；胰蛋白酶 美國Promega公司；30g/100mL丙烯酰胺貯備液、1.0mol/L Tris-HCl緩沖液(pH6.8)、1.5mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.8)、10g/100mL過硫酸銨、10g/100mL SDS溶液、N, N, N,, N, -四甲基乙二胺(TEMED)溶液；5×樣品緩沖液(1.25mL 1.0mol/L Tris-HCl緩沖液(pH6.8)，0.5g SDS，2.5mL 100%甘油，25mg溴酚藍，0.25mL β-巰基乙醇，全部混合后用水稀釋定容至5mL)；電極緩沖液(0.025mol/L Tris，0.192mol/L甘氨酸，0.1g/100mL SDS，pH8.3)；染色液(0.2g/100mL考馬斯亮藍R-250，45%甲醇，10%冰醋酸)；脫色液(10%冰醋酸，25%乙醇)。

LTQ Orbitrap XL質譜儀 美國Thermo公司；C18反相色譜柱 美國Michrom Bioresources公司；SCIENTZ-11D型超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物儀器公司；小型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 酪蛋白的提取

取20mL新鮮水牛奶，4000r/min離心20min，收集下層脫脂乳，1mol/L HCl溶液調pH值至4.6，4000r/min離心15min，棄上清。沉淀用蒸餾水洗滌兩次，丙酮洗滌兩次，每次4000r/min離心10min，收集沉淀，風干，-2 0℃保存備用。

1.2.2 酪蛋白溶液的酶解實驗

SDS-PAGE電泳：上樣量10μL；5%濃縮膠，10%分離膠；濃縮電壓60V，分離電壓100V。

蛋白酶解：目標蛋白切膠回收，純化水洗膠兩次，加入70μL脫色液，37℃水浴30min，然后用100%乙腈脫水處理。加入還原劑，于57℃水浴1h，隨后加入同體積的烷基化試劑，室溫避光放置30min，經乙腈脫水至膠塊完全變白后于每管中加入胰蛋白酶溶液2～ 4μL，冰浴20min，再加20μL覆蓋液，37℃水浴酶解16h。酶解結束后于真空干燥儀中凍干。

1.2.3 質譜分析

凍干的酶解片段用樣品溶解液溶解，充分振蕩渦旋，于13200r/min、4℃離心10min，取上清液進行質譜分析。樣品經C18反相柱(100mm×75μm，3μm)分離后，直接用LTQ-Orbitrap XL檢測。肽段在反相柱上的洗脫梯度是5%～45%乙腈(含0.1%甲酸)洗脫60min，流速為300nL/min。

質譜主要參數設置如下：離子傳輸管溫度為200℃；電噴霧電壓是1.85kV。一級質譜在Orbitrap里掃描，掃描范圍是400～2000D，二級質譜在LTQ里用CID碰撞模式完成，標準化碰撞能量為35%，活化q值為0.25和活化時間為30ms。所以信息用Mascot軟件進行數據庫檢索，得到最合適的鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 水牛奶酪蛋白的總離子流色譜

圖1 水牛奶酪蛋白酶解液的總離子流指紋圖譜Fig.1 Total ion current fingerprint of water buffalo milk casein hydrolysate

胰蛋白酶酶解的水牛奶酪蛋白的多肽混合物經LTQOrbitrap XL液-質聯用分析，獲得樣品的總離子流色譜圖，見圖1。在質譜分析過程中，精確質量數掃描可以確定離子所帶電荷數，利用二級質譜得到的碎片離子可識別肽段的氨基酸序列。如多肽混合物中檢測出離子的m/z分別為684.4、844.5、995.6、1014.4，精確質量數掃描表明該4種離子均帶有兩個電荷，二級質譜掃描結果表明，4種離子的氨基酸序列分別為ALNEINQFY QK(圖2A)、HQGLPQGVLNENLLR(圖2B)、SPAQILQWQ VLPNTVPAK(圖2C)和FQSEEQQQMEDELQDK(圖2D)，經鑒定，這些序列分別是αs2-、αs1-、κ-和β-酪蛋白的部分肽段。

圖2 LTQ質譜鑒定得到的肽段的二級質譜圖Fig.2 MS-MS spectra of peptides identified by LTQ mass spectrometry

2.2 αs1-酪蛋白的氨基酸序列測定結果

酪蛋白酶解得到的肽混合液經LC分離后直接用LTQ-Orbitrap質譜儀檢測，識別出的部分肽段信息見表1。經鑒定明，此酪蛋白是αs1-酪蛋白前體，含有一個由15個氨基酸殘基組成的高度保守的信號肽序列。αs1-酪蛋白由199個氨基酸殘基組成，其完整的氨基酸序列見圖3。同樣的方法用于乳牛奶和山羊奶αs1-酪蛋白的氨基酸序列的分析，并將3種品種的αs1-酪蛋白進行序列比對，結果發現，水牛奶αs1-酪蛋白的序列與乳牛奶和山羊奶的αs1-酪蛋白存在多處氨基酸替換，但與山羊奶αs1-酪蛋白的差異更大，特別是在3～16位氨基酸區段。

表1 水牛奶αs1-酪蛋白的肽段鑒定Table1 Peptides identified in water buffalo milk αs1-casein

圖3 水牛奶、乳牛奶和山羊奶αs1-酪蛋白的氨基酸序列對比Fig.3 Comparison of amino acid sequences of water buffalo, cow and goat milkαs1-caseins

2.3 αs2-酪蛋白的氨基酸序列測定結果

實驗中未搜索到與水牛奶αs2-酪蛋白相匹配的氨基酸序列，按Mascot得分、匹配的片段數和覆蓋率等進行綜合評判，僅搜索到乳牛奶αs2-酪蛋白前體相關信息(表2)。這可能是因為水牛奶中αs2-酪蛋白的氨基酸序列與乳牛奶αs2-CN的氨基酸序列高度一致，結果有待進一步的證明。從實驗結果可推測，在鑒定酪蛋白的種屬來源時，以αs2-CN的氨基酸序列為標準容易發生錯誤。

表2 乳牛奶αs2-酪蛋白的肽段鑒定Table2 Peptides identified in cow milkαs2-casein

圖4 乳牛奶和山羊奶αs2-酪蛋白的氨基酸序列對比Fig.4 Comparison of amino acid sequences of water buffalo, cow and goat milkαs2-caseins

圖4是乳牛奶與山羊奶αs2-酪蛋白的氨基酸序列對比。與αs1-酪蛋白一樣，αs2-酪蛋白也含有一個由高度保守的15個氨基酸組成的信號肽序列。以乳牛奶αs2-酪蛋白的序列為基準，山羊奶αs2-酪蛋白在14～15個氨基酸區段多了一個氨基酸(N)，即天冬酰胺，在29～41氨基酸區段與乳牛奶的差異最大，氨基酸替換頻繁。如乳牛奶αs2-酪蛋白序列中第16位上的絲氨酸殘基(S)被替換為山羊奶αs2-酪蛋白上的苯丙氨酸殘基(F)，G55替換為R55，R170替換為Y170，等。

2.4 β-酪蛋白的氨基酸序列的測定結果

表3 水牛奶β-酪蛋白的肽段鑒定Table3 Peptides identified in water buffalo milk β-casein

表3是水牛奶β-酪蛋白前體的部分肽段信息。β-酪蛋白有一個高度保守的15個氨基酸殘基的信號肽序列，成熟的β-酪蛋白序列隨物種的改變而發生不同氨基酸的替換。質譜鑒定結果表明，水牛奶β-酪蛋白由209個氨基酸殘基組成，其序列與乳牛奶β-酪蛋白僅有5個氨基酸的替換，該結論與Fiat等[14]的研究結果一致。

圖5 水牛奶、乳牛奶和山羊奶β-酪蛋白的氨基酸序列對比Fig.5 Comparison of amino acid sequences of water buffalo, cow and goat milkβ-caseins

由圖5可知，5個氨基酸替換分別發生在第25、41、68、92、148位殘基上。山羊奶β-酪蛋白只含有207個氨基酸殘基，在第180、181氨基酸位點上缺失了兩個氨基酸：酪氨酸(Y)和脯氨酸(P)，與水牛奶β-酪蛋白相比，共有12處的氨基酸被替換。

2.5 κ-酪蛋白的氨基酸序列測定結果

表4 水牛奶κ-酪蛋白的肽段鑒定Table4 Peptides identified in water buffalo milk κ-casein

κ-酪蛋白與其他酪蛋白組分不同，是唯一對鈣不敏感且含有糖基的組分，在酪蛋白膠體的穩定性方面也起著重要的作用。LTQ-Orbitrap質譜鑒定結果表明，κ-酪蛋白前體含有190個氨基酸，部分肽段信息見表4。與其他3種酪蛋白組分不同[15]，κ-酪蛋白有一個由21個高度保守的氨基酸殘基組成的信號肽序列。

水牛奶κ-酪蛋白完整的氨基酸序列以及與乳牛奶和山羊奶的κ-酪蛋白的氨基酸序列的對比見圖6。

圖6 水牛奶、乳牛奶和山羊奶κ-酪蛋白的氨基酸序列對比Fig.6 Comparison of amino acid sequences of water buffalo, cow and goat milk κ-caseins

如圖6所示，水牛奶和乳牛奶的κ-酪蛋白都是由169個氨基酸殘基組成的，而山羊奶的κ-酪蛋白則是由171個氨基酸殘基組成的，在131～132氨基酸區段增加了兩個氨基酸：纈氨酸(V)和組氨酸(H)。經比對，3種不同品種來源的κ-酪蛋白在第120～169氨基酸區段的差異較其他區段的差異大，氨基酸替換現象頻繁。

3 結 論

酪蛋白經胰蛋白酶酶解的肽段，通過C18反相柱分離后直接用LTQ-Orbitrap質譜儀進行鑒定分析。搜索數據庫獲得來源于水牛奶的αs1-、β-、κ-酪蛋白的氨基酸全序列，αs2-酪蛋白僅分析到與之匹配度最高的來源于乳牛奶的氨基酸序列。同樣的方法分析乳牛奶和山羊奶酪蛋白組分的氨基酸序列，并與水牛奶相對應的組分的序列比對，結果表明，不同品種的乳源酪蛋白的氨基酸序列均不相同，存在氨基酸替換現象。在酪蛋白的氨基酸序列對比中，水牛奶與山羊奶的差異比與乳牛奶的差異大。

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Identification of Water Buffalo Caseins by Liquid Chromatography and LTQ-Orbitrap Mass Spectroscopy

WANG Li-na，XU Ming-fang*，CHENG Xi-fei，XIANG Ming-xia，LI Zi-chao，LI Yun-kai
(College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

A rapid and efficient method to analyze the amino acid sequence of casein was presented using LTQ-Orbitrap mass spectroscopy coupled with liquid chromatography. In order to understand the amino acid sequence and substitution of cow, water buffalo and goat caseins, LTQ-Orbitrap mass spectroscopy coupled with liquid chromatography was used to analyze 4 major casein components, and their complete amino acid sequences were acquired by database searching. The amino acid substitutions of cow milk caseins were markedly lower than those of goat milk caseins. Thus, this study demonstrates that the amino acid sequences of cow milk caseins are more stable than those of goat milk caseins.

water buffalo milk；casein；amino acid sequence；casein structure；LTQ-Orbitrap mass spectrometry

Q657.6

A

1002-6630(2012)01-0098-05

2011-07-18

廣東省科技計劃項目(2009B011300003)

王麗娜(1985—)，女，碩士，研究方向為應用微生物及微生物工程。E-mail：wln4828@163.com

*通信作者：徐明芳(1962—)，女，教授，博士，研究方向為乳品科學與工程。E-mail：txmfxmf2006@126.com