快速分析彝藥桃樹寄生抗氧化成分

樸香蘭，鄧長芹，陳虎彪，王 進

(1. 中央民族大學中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院，北京 100081；2. 香港浸會大學中醫(yī)藥學院，香港)

快速分析彝藥桃樹寄生抗氧化成分

樸香蘭1，鄧長芹1，陳虎彪2，王 進1

(1. 中央民族大學中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院，北京 100081；2. 香港浸會大學中醫(yī)藥學院，香港)

目的：快速分離、鑒定彝藥桃樹寄生的抗氧化成分。方法：通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 自由基清除實驗，評價彝藥桃樹寄生的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇及水萃取物的抗氧化作用，利用生物活性-高效液相跟蹤方法，快速分離、鑒定其有效成分。結果：從彝藥桃樹寄生的二氯甲烷萃取物中分離、鑒定出有效成分為松脂酚(pinoresinol)。結論：利用生物活性-高效液相跟蹤方法可以快速分離、鑒定彝藥桃樹寄生中的抗氧化成分，可應用于其他天然植物活性成分的快速篩選。

彝藥桃樹寄生；DPPH自由基清除作用；生物活性-高效液相跟蹤方法；松脂酚

隨著基礎醫(yī)學和生命科學的不斷發(fā)展，人們對自由基的研究越來越多，其中就有大量關于自由基與疾病的研究。自由基作為機體的正常代謝產(chǎn)物，在平衡狀態(tài)下，其在抗菌、消炎和抑制腫瘤等方面具有重要作用和意義；一旦平衡被打破，如機體受到疾病或某些外源性藥物和毒物的侵害，自由基便會產(chǎn)生強大的傷害作用，造成生物膜的脂質(zhì)過氧化損傷，引起酶、氨基酸、蛋白質(zhì)的氧化破壞，對內(nèi)臟器官、免疫系統(tǒng)的形態(tài)功能產(chǎn)生影響，從而引起機體疾病，甚至死亡[1]。

近年來，天然植物倍受推崇，如何首烏、黃芪、人參、紅景天等，我國少數(shù)民族地區(qū)的天然植物的應用亦表現(xiàn)出良好的應用前景[2-5]。通過前期對部分少數(shù)民族常用植物的篩選，發(fā)現(xiàn)彝藥桃樹寄生具有較強的抗氧化活性。

彝藥桃樹寄生為桑寄生科(Loranthaceae)鈍果寄生屬(Taχillus)的柳葉鈍果寄生(Taχillus delavayi (Van Tiegh.) Danser)的寄生全株，又名柳樹寄生，主產(chǎn)于云南、四川、貴州、廣西、廣東、湖南、江西、福建、臺灣，為薔薇科植物桃樹上寄生的寄生全株。性溫、味澀，具有溫經(jīng)活血、調(diào)經(jīng)暖宮之功效。彝醫(yī)藥書《聶蘇諾期》就有收載桃樹寄生[6]，彝醫(yī)用于治療不孕癥、婦科附件炎等。而桑寄生科在《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，有補肝腎、強筋骨、祛風濕、安胎元功能。《中國藥典》2005年版收載的桑寄生為桑寄生科植物桑寄生(Taχillus chinensis (DC.)Danser)的干燥帶葉莖枝，用于風濕痹痛、腰膝酸軟、筋骨無力、崩漏經(jīng)多、妊娠漏血、胎動不安、高血壓等[7]。彝藥桃樹寄生與中藥桑寄生是同一科同一屬而不同種植物，它們的功能主治也有所不同。桑寄生的物質(zhì)基礎及其生物活性研究有些報道[8-11]，然而，彝藥桃樹寄生的有效成分的研究報道較少，因此本研究選擇彝藥桃樹寄生進行抗氧化有效成分的分析。

然而，天然產(chǎn)物中成分多而復雜，用傳統(tǒng)的分離方法，不但需要很多時間，而且浪費不必要的溶劑及勞動力。本研究采用生物活性-高效液相色譜跟蹤(bioassay-linked HPLC)方法，快速分離、鑒定桃樹寄生中的抗氧化成分，以期為天然植物的開發(fā)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

彝藥桃樹寄生采集于云南省昆明市祿勸縣烏蒙鄉(xiāng)，經(jīng)香港浸會大學陳虎彪教授鑒定為桑寄生科鈍果寄生屬的柳葉鈍果寄生。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 日本W(wǎng)ako Pure Chemical Industries公司；硅膠 青島海洋化工廠分廠；所有化學試劑均為分析純 北京化工廠。

1.2 儀器與設備

DPBRUKER DPX 300核磁共振儀 瑞士Bruker公司；Agilent 1100 Series LC/MSD Trap (VL) 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；Waters 600色譜儀高效液相色譜儀(配Waters2996檢測器) 美國Waters公司；YMC柱(RP-18，250mm × 4.6mm，5μm) 日本YMC公司； Benchmark Plus 酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 彝藥桃樹寄生有效成分的提取、分離

彝藥桃樹寄生5.0kg，用10、8、8倍量的80% 甲醇加熱回流提取3次，每次3h，合并3次提取液，減壓濃縮，真空干燥，得甲醇提取干膏(301.8g)。甲醇提取物用水混懸，依次用二氯甲烷(3次)、正丁醇(3次)萃取。分別得到二氯甲烷(TDD)、正丁醇(TDB)和水萃取物(TDW)11.3、224.6、48.0g，并對各部位進行DPPH自由基清除實驗。

1.3.2 DPPH自由基清除實驗

參照參考文獻[12]稍加修改。用乙醇溶解的不同質(zhì)量濃度的樣品100μL與60μmol/L DPPH溶液100μL，加入96孔板中，混勻后，室溫避光放置30min，然后在波長517nm處測OD值，測定DPPH自由基清除率，與不加樣品的對照組進行DPPH自由基清除效果的比較，然后用半數(shù)有效值IC50(抑制50%的DPPH自由基生成所需樣品的質(zhì)量濃度)表示抗氧化活性。DPPH自由基清除率的計算公式如式(1)。

式中：OD空為加DPPH的空白溶液孵育后的OD值；OD空0為空白溶液孵育前的OD值；OD樣為加DPPH的樣品溶液孵育后的OD值；OD樣0為樣品溶液孵育前的O D值。

1.3.3 TDD部位有效成分的分離

桃樹寄生的二氯甲烷萃取物(TDD)上樣于硅膠柱，用乙酸乙酯、石油醚作為洗脫液，以1:100、1:50、1:30、1:15、1:10、1:1和100%乙酸乙酯順序洗脫。對流出液進行硅膠板點樣與展開，根據(jù)Rf值將TDD分成10個組分(TDD1～TDD10)，并對各組分進行DPPH自由基清除實驗，比較它們的抗氧化活性。

對抗氧化活性較強的TDD8進行生物活性-高效液相跟蹤，鑒定有效成分。TDD8用甲醇配成2mg/mL的溶液，進樣20μL于高效液相分析柱(YMC柱)。高效液相使用水和甲醇作為溶劑系統(tǒng)，以甲醇50%(0min)～甲醇100%(30min)洗脫，流速為1mL/min，流出液以300μL/孔的速度接樣于96孔板，并放在通風廚中揮發(fā)溶劑。溶劑揮發(fā)后的96孔板用于DPPH自由基清除實驗，在9.8min處出現(xiàn)的峰顯示較高的DPPH自由基清除活性，并用半制備分析柱(YMC柱)進行分離、純化有效成分TDD8-2。

1.3.4 統(tǒng)計學分析方法

2 結果與分析

2.1 桃樹寄生DPPH自由基清除活性

對桃樹寄生的甲醇提取物及其TDD、TDB和TDW進行DPPH自由基清除實驗，結果表明各部位樣品均顯示濃度依賴性的抗氧化活性，TDD對DPPH的半數(shù)抑制率IC50達到(74.50 ± 1.24 )μg/mL，尤其是TDB抗氧化效果最強，其IC50值為(22.21 ± 2.05)μg/mL(圖1)。

圖1 桃樹寄生的DPPH自由基清除活性Fig.1 DPPH radical scavenging activity of the methanol extract and its different solvent fractions

2.2 TDD部位有效成分的分離、鑒定

為了系統(tǒng)地進行桃樹寄生的抗氧化有效成分的研究，首先從非極性的TDD著手進行抗氧化有效成分的分析，然后陸續(xù)對桃樹寄生的正丁醇及水萃取物進行有效成分的分離、鑒定。桃樹寄生的TDD經(jīng)硅膠柱分離，得到10個組分(TDD1～TDD10)，通過DPPH自由基清除實驗對上面的10個組分及TDD總樣進行分析，結果表明，除TDD1和TDD2以外，其他組分均有質(zhì)量濃度依賴性清除DPPH自由基清除活性，尤其是TDD8和TDD10顯示較強的抗氧化活性，而且TDD8組分的量相對較多，在質(zhì)量濃度50μg/mL時就對DPPH自由基清除率超過60% (圖2)。

圖3 桃樹寄生二氯甲烷萃取物活性組分的高效液相色譜(A)-抗氧化活性(B)圖Fig.3 HPLC separation peaks and antioxidant activity peaks of TDD8

圖2 桃樹寄生的二氯甲烷萃取物各組分DPPH自由基清除活性Fig.2 DPPH radical scavenging activity of different components of the dichloromethane-soluble fraction

圖4 化合物TDD8-2的氫譜Fig.4 1H-NMR spectrum of compound TDD8-2

圖5 化合物TDD8-2的碳譜Fig.5 13C-NMR spectrum of compound TDD8-2

為了分離、鑒定活性較強的TDD8中的有效成分，利用生物活性-高效液相跟蹤方法，快速確定TDD8中的有效峰。實驗結果表明，以甲醇50%(0min)～甲醇100%(30min)洗脫，流速為1mL/min的條件下，在9.8min處出現(xiàn)的峰顯示較高的DPPH自由基清除活性。因此，采用半制備分析柱，使用甲醇和水的溶劑系統(tǒng)，選擇甲醇50%等度洗脫，有選擇地針對有效成分的峰進行分離、純化，得到有效成分TDD8-2單體化合物(圖3)。

化合物TDD8-2為白色油狀物，分子式C20H22O6。有效成分TDD8-2在ESI-MS顯示準分子離子峰m/z 381 [M＋Na]＋，357 [M-H]＋，1H-NMR (300MHz, CD3OD)δ：6.92 (2H, d, J＝1.25, H-2,2＇), 6.78 (2H, bdd, J＝8.2,1.6Hz, H-6,6＇), 6.75 (2H,bdd, J＝8.2,1.7Hz, H-5,5＇), 4.67 (2H, b, J＝4.5Hz, H-7,7＇), 4.19 (2H, m, Hb-9), 3.82 (3H, s, OCH3), 3.79 (2H, m, Ha-9), 3.09 (2H, m, H-8,8＇)(圖4)。13C-NMR (75MHz, CD3OD) δ：149.1(C-3,3＇), 147.3 (C-4,4＇), 133.8 (C-1,1＇), 120.0 (C-6,6＇), 116.1 (C-5,5＇), 111.0 (C-2,2＇), 87.4 (C-7,7＇), 72.6 (C-9,9＇), 56.4 (OCH3), 55.3 (C-8,8＇)(圖5)。結合文獻[13]確定抗氧化成分TDD8-2為松脂酚(pinoresinol)(圖6)。

圖6 桃樹寄生抗氧化成分的結構式Fig.6 Chemical structure of compound TDD8-2

2.3 桃樹寄生有效成分的抗氧化活性

利用DPPH自由基清除活性檢測方法，以VC作為陽性對照，比較桃樹寄生中分離的有效成分松脂酚對DPPH自由基清除作用，結果表明它們均有質(zhì)量濃度依賴性清除DPPH自由基作用，松脂酚對DPPH自由基的IC50為(30.95 ± 1.75)μmol/L，接近VC的IC50值(23.24 ± 1.09)μmol/L。

3 結 論

桃樹寄生的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇和水萃取物都具有較強的抗氧化活性。針對量較多的桃樹寄生的二氯甲烷萃取物進行組分分離，并對活性較強的組分進行生物活性-高效液相跟蹤，快速分離、鑒定桃樹寄生的有效成分，通過ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR光譜數(shù)據(jù)，與相關文獻對照，抗氧化有效成分被鑒定為松脂酚。與陽性對照組VC比較，松脂酚顯示較強的DPPH自由基清除活性，其IC50為(30.95 ± 1.75) μmol/L，接近VC的IC50(23.24 ± 1.09)μmol/L。利用生物活性-高效液相跟蹤方法，可以快速分離、鑒定天然植物中的抗氧化成分，可應用于食品中抗氧化有效成分的快速分析。

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Rapid Analysis of Antioxidant Constituents from Taχillus delavayi, a Yi Ethnomedicinal Material

PIAO Xiang-lan1， DENG Zhang-qin1，CHEN Hu-biao2，WANG Jin1
(1. Institute of Chinese Minority Traditional Medicine, Minzu University of China, Beijing 100081, China；2. School of Chinese Medicine, Hong Kong Baptist University, Hongkong, China)

Objectives: To rapidly separate and identify antioxidant constituents from the whole plant of Taχillus delavayi, a Yi ethnomedicinal material, and assess their antioxidant activity. Methods: The antioxidant activity of the methanol extract of the medicinal material and its different solvent fractions obtained by repeated extractions sequentially with dichloromethane, n-butanol and water was assessed by DPPH free radical scavenging assay. The dichloromethane-soluble fraction was further separated by silica gel column chromatography, and a high antioxidant component named as TDD8 was obtained and analyzed by bioassay-linked HPLC and1H-NMR. Results: An individual compound named as TDD8-2 was separated from TDD8 by semipreparative HPLC and identified by1H-NMR as pinoresinol. Conclusion: The bioassay-linked HPLC method allows the rapid separation and identification of antioxidant components from medicinal materials.

Taχillus delavayi；DPPH radical scavenging activity；bioassay-linked HPLC method；pinoresinol

R282.71

A

1002-6630(2012)01-0016-04

2011-02-14

國家自然科學基金項目(30973960；81011140347)；國家民委科研項目(09ZY17)；國家大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目(NMOE)(200911003)

樸香蘭(1965—)，女，副教授，博士，研究方向為天然藥物化學。E-mail：xlpiao@163.com