微流控PCR裝置中溫度控制技術評述*

劉 勇，高 娜，朱 靈，李 飛，王貽坤，張 龍

（中國科學院安徽光學精密機械研究所光電子技術研究室，安徽合肥 230031）

0 引言

20世紀90年代初，Manz A和Widmer H M首次提出微型全分析系統（miniaturized total analysis systems）的概念［1］，其核心是微流控芯片，即以微機電系統（micro-electro-mechanical systems，MEMS）技術為依托，通過控制微通道中的流體將取樣、預處理、反應、分離和檢測等操作集成在微芯片上進行，實現分析系統的微型化、集成化、自動化與便攜化［2］。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是Mullis于1985年發明的一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。PCR的原理［3］類似于DNA的體內復制，在試管中給DNA的體外合成提供模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、Mg2+、合適的緩沖體系，進行DNA模板的變性，引物與模板的退火和引物的延伸，經過多次變性、退火和延伸后，待擴增的DNA分子或者片斷可放大幾十甚至幾百萬倍。

在PCR的熱循環中，溫度直接影響PCR擴增成功與否，較大的溫度偏差會導致擴增失敗:變性溫度太高會影響DNA聚合酶的活性;退火溫度過低會導致大量非特異性產物出現，而過高又會使擴增效率下降;不合適的延伸溫度也會對擴增產物的特異性、產量造成影響［3］。近年來研究表明［4］:提高PCR熱循環中3個溫區之間的升降溫速率，不僅能夠縮短整個PCR擴增過程所需時間，而且特異性更好。微流控芯片為PCR微型化操作提供了一條可行的途徑，較小的反應體積不僅可以大大減少試劑消耗還可提高升降溫速率。

1 微流控PCR裝置中加熱方式和冷卻方式

加熱和冷卻方式直接影響溫度的升降溫速率，決定了PCR擴增所需的時間。

1.1 微流控PCR裝置中加熱方式

微流控PCR裝置中采用的加熱方式大致可分為接觸式和非接觸式加熱兩種。接觸式加熱是將加熱源直接與微芯片接觸，以傳導方式對反應區域加熱。可采用片上集成的薄膜加熱元件，如鉑（Pt）、銦錫氧化物（Indium Tin Oxide，ITO）等;或外置加熱裝置，如金屬加熱塊、熱電制冷器（thermoelectric cooler，TEC）等。非接觸式加熱可采用紅外輻射加熱、感應加熱、微波加熱等。

1.1.1 片上集成薄膜加熱元件

薄膜加熱元件具有體積小、溫度響應速度快、控制精度高等優勢，廣泛用于微流控PCR裝置中，目前多采用Pt薄膜［5～11］作為加熱元件，升溫速率主要在 10～20 ℃ /s。

此外，ITO也有很大優勢，其薄膜厚度在nm數量級，物理化學性能穩定，與大部分襯底有良好的附著性，另外，ITO薄膜的透光性較好，便于光學檢測。戴敬等人［12］采用ITO對連續流動式芯片加熱，20～30 s后溫度上升到設定值達到穩定。

1.1.2 外置加熱裝置

最簡單的外置加熱裝置是利用電熱加熱器加熱銅［13］、鋁［14］等金屬塊。金屬塊作為外置加熱系統具有較大的體積和熱容量，升溫和冷卻速率較慢，從而限制了微反應速度。

另外一種常用的外置加熱裝置是熱電制冷器，其溫度響應快，變化范圍寬，均勻性好于線形的加熱源，具有較好的應用前景［15］。采用單片TEC很難達到要求時，可以多片一起使用［16，17］。Qiu X B 等人［16］將 PCR 微芯片夾在兩片TEC之間，形成三明治結構，該方法能較好地改善溫度梯度。如果只有單片TEC，PCR微芯片上下表面溫度相差2.5℃，如果采用兩片 TEC，溫度相差0.2℃。

1.1.3 紅外輻射加熱

紅外輻射的物理本質是熱輻射，物體的溫度越高，輻射出來的紅外線越多，這些輻射能被其他物體接收后又可轉變為熱能使其溫度升高，常用的紅外輻射源有鎢絲燈［18，19］、鹵鎢燈［20］等。通過控制紅外輻射波長，采用對紅外輻射吸收較小的材料，選擇性地加熱反應液，可以避免反應腔熱容量的影響，提高升溫速率，但是需要增加透鏡、濾波片等光學器件。

1.1.4 感應加熱

基于輻射加熱存在的能量效率不高、需要透鏡濾波片等光學器件的問題，感應加熱是一種新的有效的非接觸加熱方法。感應加熱［21］單元一般包括電力發電機、由線圈組成的振蕩回路（儲能電路）和水冷卻系統，線圈的設計是感應加熱方法中一個重要的問題。在Pal D等人［22］設計的感應加熱系統中包括2個線圈:線圈1由直徑2 mm的漆包銅線環繞在直徑10 mm的鐵氧體磁芯上組成，12 V的電池組提供直流電，交變電流由方波脈沖產生;線圈2是一個由金屬鐵制成的圓環形加熱器，外徑14mm，內徑5mm，4塊PCR微芯片通過高溫粘結在金屬加熱器上，升溫速率為6.5℃/s，該方法裝置簡單，低功耗，便于開發手攜式設備。

1.1.5 微波加熱

Fermér C等人［23］首次介紹了微波加熱，文中提到微波加熱有如下特點:沒有熱慣性，能量高度集中;溫度梯度小，能加速PCR反應;25個循環后DNA聚合酶仍有活性。Shaw K J等人［24］用銅塊做成微波腔，升溫速率能達到65℃/s。Shah J J等人［25］在微流體通道集成薄膜微波傳輸線對流體進行加熱，通過調節微波的激發頻率即可改變微波的功率，從而控制溫度。此外，調整微波傳輸線的位置可以對區域選擇性加熱。

1.1.6 其他加熱方式

Guijt R M等人［26］利用濃硫酸溶于水放熱的原理來加熱，裝置簡單，不需要額外的微機電加工過程，但是升溫速率較慢（1℃/s）。Shen K Y等人［27］通過柔性印刷電路技術制作了一種薄膜銅電阻加熱器，升溫速率為8℃/s，該方法裝置簡單，輕便，低成本，低功耗，熱耗散能力強。

1.2 微流控PCR裝置中冷卻方式

微流控PCR裝置中冷卻方式可采用自然對流或強制對 流，其 中 強 制 對 流 可 外 接 壓 縮 空 氣 源［24，25］或 風扇［5，8，9，14，19，20，27，29］，對較小的加熱區域外接壓縮空氣源冷卻效果比風扇好。強制對流方式冷卻速率較大，但是因為外接制冷系統會增加體積，集成化的程度較低。自然對流無需外界提供動力源，集成化程度較高，但速率比較低，還受周圍溫度的影響。Guijt R M等人［26］利用物理方法來制冷，通過丙酮蒸發吸熱將熱量帶走，冷卻速率較慢（1℃/s）。

2 微流控PCR裝置中溫度的測量方式

2.1 接觸式測溫

使測量體與被測介質接觸、依靠傳熱或對流進行熱交換并達到熱量平衡的測溫方法稱為接觸式測溫方法。接觸式測溫元件可以分薄膜型和非薄膜型測溫元件，薄膜型傳感器常和加熱器合二為一，集成在PCR微芯片上，主要是Pt［5，7，9，10，11］，Pt電阻的阻值與溫度呈近似線性關系，可以直接有效地對器件的溫度進行測量。非薄膜型測溫元件種類較多，其中應用較多的是熱電偶［14，16，22，24］。接觸式測溫主要優點是方法簡單，可靠，測量精度較高。但是測溫元件與被測反應液直接接觸，會造成交叉污染。若與反應腔接觸，又不能反映微流體內局部溫度變化。此外，測溫需經歷熱量的交換與平衡過程，會導致測溫過程的延遲，也會將測溫元件的熱容量添加到其中，影響其溫度。

2.2 非接觸式測溫

為了克服接觸式測溫遇到的問題，一些研究者嘗試去開發非接觸式測溫的方法，如紅外輻射溫度計［19］。紅外輻射測溫不需要任何傳遞媒介、不需要直接接觸即可測溫，測溫速度快且不會對被測物產生大的干擾。其缺點是容易受外界因素的干擾，導致測量誤差大，且結構復雜，價格昂貴。

以上的方法都只能反映局部溫度，不能觀察溫度的空間分布情況，為了獲得空間的實時的溫度分布信息，又出現了其他新的方法，如熱致變色液晶（thermochromic liquid crystal，TLC）測溫技術［9］、指示劑熒光強度變化測溫技術［12，18，25，29，30］，將 TLC 或指示劑添加到 PCR 反應液中，由溫度變化導致的TLC顏色的變化或熒光強度的變化可以反映整個PCR反應腔內的溫度情況。

3 結論

綜上所述，接觸式加熱體積小，集成化程度高，容易實現微型化和便攜化，但添加了額外的熱容量，不利于熱循環的快速進行;非接觸式加熱克服了接觸式加熱的主要缺點，加熱元件的熱容量不再參加PCR反應體系的溫度循環，升溫度速率一般要優于接觸式加熱，但非接觸式加熱的設備一般比較大，相對復雜，價格昂貴。采用自然冷卻不需要任何外置設備，但是冷卻速率較慢，通常還是外接風扇或是壓縮空氣源強制對流來加快冷卻。接觸式測溫雖然簡單可靠，但并不能實時反映被測介質的溫度，也不能反映整個區域的溫度分布情況。通過添加TLC或熒光染料，找到其與溫度的相關性，將測溫轉換為觀察TLC的顏色或測熒光染料的熒光強度來實現，能實時反映溫度的空間分布和隨時間的變化率，為溫度的測量提供了一種很好的方法。

從集成化、微型化、便攜化的角度來看，更多的還是采用集成薄膜元件來加熱和測溫，常將Pt薄膜集成在PCR微芯片底部，集加熱和測溫于一體。

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