Bcl-2基因家族與重癥肌無力

袁正洲 綜述，李作孝 審校

(瀘州醫學院附屬醫院神經內科，四川瀘州 646000)

重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是一種主要由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody,AchRab)介導的CD4+T細胞依賴的自身免疫性疾病。病變部位位于神經-肌肉的突觸后膜，該膜上煙堿乙酰膽堿受體(nAchR)受到攻擊后數量減少，導致神經肌肉接頭遞質傳遞障礙[1]。細胞凋亡(apoptosis)又稱之為細胞程序化死亡(programmed cell death)，是指在特定內源和外源信號誘導下，細胞內死亡程序激活而致的細胞主動自殺，也是增殖的淋巴細胞被清除的主要方式[2]。細胞凋亡的發生、發展受到多種凋亡相關基因調控。引起MG免疫應答的具體始動環節目前還不是很清楚，但有研究表明淋巴細胞凋亡基因調節失控與MG的發生及發展關系緊密[3]。Bcl-2是調控淋巴細胞凋亡的重要家族，該家族成員眾多，不同成員對凋亡作用亦有差異。本文對Bcl-2基因家族與MG淋巴細胞凋亡的關系進行綜述。

1 Bcl-2基因家族的組成及功能

1.1Bcl-2基因家族的組成 Bcl-2基因定位于18號染色體(18q21)，包括2個內含子及3個外顯子，其第1個外顯子無翻譯功能，第2個內含子具有非翻譯區。第2、3個外顯子具備編碼的功能，Bcl-2基因產物通過這兩個外顯子編碼[4]。Bcl-2基因家族可分為3個亞家族：(1)Bcl-2亞家族：抗細胞凋亡，成員有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Al和Diva等；(2)Bax亞家族：促進細胞的凋亡，如Bak、Bcl-xS、Bax及Bok等；(3)BH3-only(Bcl-2 homology 3 only)蛋白亞家族：具有促進細胞凋亡的功能，成員包括Bik、Bad、Bid、Bim、Hrk、Puma、Noxa等[5-6]。

1.2Bcl-2基因家族的結構及功能 Bcl-2家族蛋白的主要結構由2大結構域構建：(1)位于羧基端的跨膜結構域；(2)數量不等(1～4個)的BH。BH-3結構域與促進細胞的凋亡密切相關，在促進細胞凋亡進程中扮演著至關重要的角色，被視為死亡結構域[7]。BH-4結構域作為抗凋亡蛋白所特有的一種結構域，在其缺失的情況下，可使抗凋亡蛋白出現功能活性的喪失。螺旋結構BH1-4結構域出現在大多數的抗凋亡蛋白亞家族結構域中。BH-3結構域則為促凋亡蛋白亞家族結構所共享，但促凋亡蛋白亞家族缺少a螺旋片段BH-4結構域，而BH3-only蛋白亞家族結構中僅含有BH-3結構域。大部分成員都有跨膜結構域(transmembrane domain,TM)，這有助于它們固定在如內質網及線粒體等胞內細胞器膜上。

Bcl-2家族蛋白的相對濃度調控細胞凋亡線粒體通路，在其調控下，蛋白質由線粒體膜間隙轉移到胞質中[8]。Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bak及Bax作用于線粒體，通過在其外膜孔釋放細胞色素c激活細胞的凋亡程序。Bak和Bax的聚合物(二聚體或多聚體)形成細胞色素c通過的孔洞，而抗凋亡蛋白Bcl-2與Bcl-xL通過競爭性地與Bak和Bax結合而阻止細胞色素c漏出，影響胱冬酶3(caspase-3)的激活，從而抑制細胞凋亡[9]。

Bcl-2的表達在淋巴細胞成熟及建立正常免疫系統過程中呈階段性的變化。在胸腺組織的T淋巴細胞進行陽性選擇過程中Bcl-2表達出現下降趨勢，從而誘導CD4+CD8+雙陽性細胞進入凋亡途徑，而CD4+及CD8+單陽性T淋巴細胞中的Bcl-2水平卻表現為上升趨勢，這使T淋巴細胞進一步發育成熟,進而建立起穩定的正常免疫系統[10]。Bcl-2可結合與細胞凋亡有關的R-rasp23、Raf-1等信號傳導分子，通過影響分子信號的傳導通路而抑制細胞凋亡[11]。

2 Bcl-2基因家族在MG發病中的作用

2.1胸腺組織中Bcl-2基因家族表達與MG發病的關系 65%以上MG患者胸腺增生，病理改變為淋巴生發中心增生，其中心有B淋巴細胞存在。10%MG并發胸腺瘤，病理改變為淋巴細胞增生，大部分為T淋巴細胞。通過原位雜交技術對MG伴胸腺增生患者進行研究，發現正常胸腺組織中的Bcl-2主要表達在髓質和少量皮質中，生發中心只有很少的Bcl-2陽性細胞，上皮組織中則不表達陽性細胞。在MG合并胸腺瘤患者中，Bcl-2的蛋白和mRNA在上皮組織中出現表達，同時髓質中Bcl-2表達高于對照組。該實驗同時表明Bax的蛋白和mRNA在正常胸腺組織中表達主要在髓質、少量在皮質。而在MG胸腺中，Bax蛋白和mRNA表達主要在上皮、少量在髓質，且生發中心高表達Bax產物，Bax陽性細胞數量與MG的Osserman分型呈正相關。這意味著Bcl-2基因表達的上調可導致胸腺上皮細胞具備抗凋亡能力，最終致使MG發生進展，而Bax在生發中心高表達則提示高凋亡指數[12]。

Kondo和Yoshino[13]用TUNEL法對MG患者的胸腺生發中心檢測原位DNA片段，發現MG發病可能是因為Bcl-2的上調，導致自身反應性B淋巴細胞逃脫陰性選擇，產生了過量的AchRab從而引發自身性免疫反應。另有研究[14]報道稱MG患者的胸腺中Bcl-2基因表達增加，抑制了正常免疫細胞的凋亡發生。其免疫細胞成熟過程中因自身反應性胸腺細胞受損，異常克隆細胞產生免疫耐受紊亂，使淋巴細胞增殖異常而致B淋巴細胞持續分泌AchRab。由此可見，Bcl-2基因表達增加可抑制MG患者淋巴細胞的正常凋亡過程，這可能是導致MG患者自身免疫疾病發生的機制之一。

Bax與Bcl-2的比例決定了細胞凋亡的易感性。通過對經過胸腺切除術治療的MG患者進行研究，Salakou等[15]發現MG患者胸腺中的Bcl-2水平明顯高于陰性對照組，陽性胸腺組織重量顯著比陰性胸腺增加。Bcl-2基因下調可破壞胸腺細胞的分化更新，長期存活的細胞大量累積，從而導致MG胸腺腫瘤的發生。Bax的mRNA及蛋白質促進MG淋巴細胞凋亡，Bax與Bcl-2的比例可上調caspase-3從而激活和調節與MG進展相關的細胞凋亡。同時發現在Bax/Bcl-2比值小于1的情況下，即使沒有進行藥物治療，也可出現病情改善甚至完全緩解的情況，這個比值可能是一個獨立的預后因素。

2.2外周血Bcl-2基因家族表達與MG發病的關系 在MG患者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中，Bcl-2的mRNA表達較對照組明顯高于對照組，且CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群及CD19+細胞Bcl-2蛋白表達也明顯升高，同時CD3+T細胞蛋白表達Bcl-2的平均熒光強度亦升高[16]。PBMC中Bcl-2的mRNA相對表達量與MG患者病情嚴重程度呈正相關，極重型、重型及中型患者PBMC中Bcl-2的mRNA表達水平要明顯高于輕型患者[17]。

MG患者PBMC中Bcl-2高表達，而Bad、Bax表達水平低[18]。CD4+T淋巴細胞的凋亡程度顯著低于空白對照組，而CD8+T淋巴細胞的凋亡程度介于二者之間，說明MG患者PBMC中T淋巴細胞凋亡存在障礙，且凋亡障礙以CD4+T淋巴細胞為主。這導致清除活化的自身反應性T細胞不及時，T輔助細胞的功能相對亢進，B細胞在活化的T細胞作用下增殖活躍，進而導致免疫應答過強，產生眾多針對自身免疫系統的抗體，從而致使MG的發生[19]。

MG患者的PBMC的CD4+T淋巴細胞凋亡程度因不同臨床類型及預后而高低明顯不同。與空白對照組相比，MG患者組中PBMC的CD8+T淋巴細胞所占比例顯著下降，CD4+T與CD8+T的比值明顯增高，而CD4+T細胞所占比例無顯著差異。這表明MG患者的T淋巴細胞亞群分布存在異常，抑制性T淋巴細胞的數量顯著降低，導致T淋巴細胞的抑制能力下降，B淋巴細胞在T細胞亞群異常分布的調節下失控[20]。Bcl-2基因在胸腺T淋巴細胞進行陽性選擇時表達下降，調節CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞進入正常的凋亡程序，而CD4+及CD8+單陽性T淋巴細胞的Bcl-2表達則上調使之進一步發育，由此構建正常的免疫體系。MG患者中胸腺T淋巴細胞進行陽性選擇時，Bcl-2基因表達顯著下降，從而促使CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞進入異常的細胞凋亡程序[21]。

Bcl-2表達異常致使免疫細胞的凋亡失控，因而引起MG患者細胞免疫調節功能紊亂。應用糖皮質激素治療后，MG患者血清里面Bcl-2的mRNA水平表現為明顯的降低且其水平與病情嚴重程度相關，這表明Bcl-2的mRNA水平可作為反映MG治療的效果的一個指標[22]。Delfino等[23]的研究表明，表達Bcl-2的PBMC在培養過程中不但能夠長期生存，還可以持續產生反應程度劇烈的抗原，而這種抗原反應產生的變化是活化的T淋巴細胞凋亡被強力抑制的結果，且與Bcl-2基因家族中抗凋亡亞族的表達呈正相關。

3 展 望

Bcl-2基因家族作為調控淋巴細胞凋亡的重要因子，在MG的早期診斷、判斷預后及治療中發揮重要作用。目前，國內外治療MG大多是通過胸腺切除術、膽堿酯酶抑制劑、腎上腺皮質激素及免疫抑制劑等方法[24]，但其長期全身廣泛性的免疫抑制會產生諸多的不良反應。應用基因工程表達凋亡基因細胞的外蛋白，能有效消除自身免疫[25]。隨著Bcl-2基因家族作用機制逐步明確，通過糾正其對淋巴細胞凋亡調節失控，從而改善乃至完全緩解MG的病情，可成為治療MG新的研究方向。以Bcl-2基因家族作為靶點研發新的治療藥物和設計新的治療方案，對MG的臨床治療具有潛在重大價值。

[1]Rowland,Lewis P.Merritt′s Neurology[M].12th ed.Philadelphia:Lippincott Williams & Wilkins,2010:845-849.

[2]Peter ME.Programmed cell death:apoptosis meets necrosis[J].Nature,2011,471(7338):310-312.

[3]Aruna BV,Ben-David H,Sela M,et al.A dual altered peptide ligand down-regulates myasthenogenic T cell responses and reverses experimental autoimmune myasthenia gravis via up-regulation of Fas-FasL-mediated apoptosis[J].Immunology,2006,118(3):413-424.

[4]Wong WWL,Puthalakath H.Bcl-2 family proteins:the sentinels of the mitochondrial apoptosis pathway[J].IUBMB Life,2008,60(6):390-397.

[5]Zhou FF,Yang Y,Xing D.Bcl-2 and Bcl-xL play important roles in the crosstalk between autophagy and apoptosis[J].FEBS J,2011,278(3):403-413.

[6]Chipuk JE,Moldoveanu T,Llambi F,et al.The BCL-2 family reunion[J].Mol Cell,2010,37(3):299-310.

[7]Delft MF,Huang DC.How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis[J].Cell Res,2006,16(2):203-213.

[8]Salakou S,Kardamakis D,Tsamandas AC,et al.Increased Bax/Bcl-2 ratio up-regulates caspase-3 and increases apoptosis in the thymus of patients with myasthenia gravis[J].In Vivo,2007,21(1):123-132.

[9]Lakhani SA,Masud A,Kuida K,et al.Caspases 3 and 7:key mediators of mitochondrial events of apoptosis[J].Science,2006,311(5762):847-851.

[10]Wang YH,Yan Y,Rice JS,et al.Enforced expression of the apoptosis inhibitor Bcl-2 ablates tolerance induction in DNA-reactive B cells through a novel mechanism[J].J Autoimmun,2011,37(1):18-27.

[11]Barbie DA,Tamayo P,Boehm JS,et al.Systematic RNA interference reveals that oncogenic KRAS-driven cancers require TBK1[J].Nature,2009,462(7269):108-112.

[12]Salakou S,Tsamandas AC,Bonikos DS,et al.The potential role of Bcl-2,Bax,and Ki67 expression in thymus of patients with myasthenia gravis,clinicopathologic and their correlation with parameters[J].Eur J Cardiothorac Surg,2001,20(4):712-721.

[13]Kondo E,Yoshino T.Expression of apoptosis regulators in germinal centers and germinal center-derived B-cell lymphomas:insight into B-cell lymphomagenesis[J].Pathol Int,2007,57(7):391-397.

[14]Okumura M,Fujii Y,Shiono H,et al.Immunological function of thymoma and pathogenesis of paraneoplastic myasthenia gravis[J].Gen Thorac Cardiovasc Surg,2008,56(4):143-150.

[15]Salakou S,Kardamakis D,Tsamandas AC,et al.Increased Bax/Bcl-2 ratio up-regulates caspase-3 and increases apoptosis in the thymus of patients with myasthenia gravis[J].In Vivo,2007,21(1):123-132.

[16]Okumura M,Inoue M,Kadota Y,et al.Biological implications of thymectomy for myasthenia gravis[J].Surgery today,2010,40(2):102-107.

[17]張士孟,劉敏,張晨,等.重癥肌無力患者外周血單核細胞凋亡調控基因表達的研究[J].臨床神經病學雜志,2007,20(3):179-181.

[18]Irony-Tur-Sinaia M,Grigoriadisb N,Tsiantoulas D,et al.Immunomodulation of EAE by alpha-fetoprotein involves elevation of immune cell apoptosis markers and the transcription factor FoxP3[J].J Neuro Sci,2008,279(1):80-87.

[19]Eymard B.Antibodies in myasthenia gravis[J].Rev Neurol,2009,165(2):137-143.

[20]李作孝,賴成虹,榮本兵,等.重癥肌無力患者外周血T淋巴細胞亞群凋亡的研究[J].中華神經醫學雜志,2006,5(8)：803-805.

[21]Jung C,Stoeckle C,Wiesmüller KH,et al.Complementary strategies to elucidate T helper cell epitopes in myasthenia gravis[J].J Neuroimmunol,2008(201-202):41-49.

[22]Spokoini R,Kfir-Erenfeld S,Yefenof E,et al.Glycogen synthase kinase-3 plays a central role in mediating glucocorticoid-induced apoptosis[J].Mol Endocrinol,2010,24(6):1136-1150.

[23]Delfino DV,Pozzesi N,Pierangeli S,et al.Manipulating thymic apoptosis for future therapy of autoimmune diseases[J].Curr Pharm Des,2011,17(29):3108-3119.

[24]Ropper AH,Samuels MA.Adams and victor′s principles of neurology[M].9th Edition.New York:The McGraw-Hill Companies Inc,2009:1250-1259.

[25]Yolcu ES,Gu X,Lacelle C,et al.Induction of tolerance to cardiac allografts using donor splenocytes engineered to display on their surface an exogenous fas ligand protein[J].J Immunol,2008,181(2):931-939.