組織工程人工韌研究進展＊

蔡長儐綜述，楊 柳審校

（1.第三軍醫大學西南醫院關節外科中心，重慶 400038；2.解放軍77123部隊醫院，四川綿陽 621000）

前交叉韌帶（ACL）是膝關節內一條重要的韌帶，同時它也是膝關節韌帶損傷中最常見的。在美國，每年有超過200 000例ACL損傷的病例，據估計每年直接花費30億美元［1－2］。敖英芳等［3］在2000年報道，中國現役集訓運動員前交叉韌帶損傷的總發病率為0.47%。臨床上ACL損傷也日益常見。最近一項研究［4］，在10年期間19 530例運動損傷患者，有37%的患者有膝關節損傷，其中45.4%的患者有不同程度的ACL損傷，并且33.9%的患者需要進行手術治療，Majewski等［4］研究認為現有的修復技術，長期臨床觀察的成功率為85%～90%。

ACL起自股骨外髁內側面后部，向前、向遠端、向內穿關節腔附著于脛骨平臺髁間棘前部［5］。平均長度31～38mm，中間部分平均寬度為10～12mm，橫截面近似卵圓形，平均面積女性和男性分別為36mm和44mm。ACL組織學上屬于致密膠原組織。膠原纖維束呈平行排列，ACL主要細胞外基質成分為Ⅰ型膠原、還含有Ⅲ型膠原、Ⅱ型膠原、V型膠原、彈性蛋白、蛋白多糖、水和細胞等。Ⅲ型膠原位于Ⅰ型膠原束間的疏松結締組織內。研究表明，ACL極限抗張力強度為（2 020±264）N，最大形變（1 519±315）mm。ACL剛度為240 N／mm，彈性模量為278MPa，極限抗張強度為35MPa［6］。所受應力變化與膝關節屈伸位置、肌肉收縮狀態、負重或者非負重都有關系。

1 ACL置換

ACL置換重建現有多種選擇，包括自體組織移植重建，異體組織移植重建和人工韌帶重建。自體移植（從患者其他部位取材移植），其中B-PT-B被認為是治療 ACL損傷的金標準［7－8］。自體移植重建具有良好的力學強度，可促進細胞增殖和組織生長。從患者身上取材避免了排斥反應和傳染疾病的危險。但是，自體移植存在一些難以克服的問題：自體移植組織來源有限，而且需要從其他部位取材，有導致供區并發癥的可能［9］。同種異體移植重建（從尸體上取材移植）和自體移植重建具有同樣良好的力學強度，可促進細胞增殖和組織生長［10］，同時避免了從患者其他部位手術取材，沒有供區取材量的限制。但是，同種異體移植重建存在傳染疾病、感染、免疫排斥反應的問題。而且移植物在消毒以后其力學性能也隨之改變［11］。由人工合成高分子材料制作的人工韌帶近年來在臨床治療中得到一定范圍的使用。人工合成高分子材料用于制作人工韌帶并應用于臨床的有：聚對苯二甲酸乙二醇酯（Leeds-Keio韌帶、LARS）、碳纖維、聚四氟乙烯（Gore-Tex）、聚丙烯（Kennedy Ligament Augmentation Device）。其中 Leeds-Keio韌帶、LARS、Kennedy Ligament Augmentation Device是編織結構的人工韌帶［12］。這些人工合成高分子材料制作的人工韌帶已經通過美國FDA的相關測試，但由于上述人工韌帶存在變性、磨損、斷裂、導致滑膜炎，人工韌帶與骨界面結合不良、應力遮擋、缺乏遠期臨床療效報道和大規模對照研究等問題，因此，不推薦作為ACL修復的首選［13］。人工合成高分子材料制作的人工韌帶主要分為3類：永久替代型、加強型韌帶也稱為韌帶 加 強 裝 置 （ligament augmentation device，LAD）、支 架型14。永久替代型的人工韌帶要求在力學性能上與所替代的韌帶相近，它不能促進組織向其內部生長。因此，此類韌帶存在疲勞和蠕變導致力學性能下降甚至斷裂的問題。加強型韌帶是用于自體移植重建或異體移植重建術后早期的力學加強，其本身的力學性能較差。支架型人工韌帶是一種具有多孔隙率，可促進組織長入的移植物，并且應力由新生組織負荷的人工韌帶。這些人工合成高分子材料制作的人工韌帶在早期力學性能與正常的韌帶相近，但是，隨著時間的推移和反復應力作用下，置換失敗率也不斷增加。與骨隧道的邊緣反復摩擦產生移植物的碎片，是導致關節滑膜炎的重要原因之一［15］。

2 ACL置換的新選擇

2.1 天然聚合物 可生物降解的組織工程移植物所用材料常見Ⅰ型膠原［16］和絲蛋白［17］。膠原的優點在于能通過交叉耦合及其低抗原性改變支架的再吸收率和力學性能。這些支架經歷了早期的機械強度降低和其術后10～20周的組織重塑，這種重塑伴隨著類似于自體移植的強度增加。纖維狀蛋白質，如絲蛋白和膠原主要是由特殊的氨基酸序列構成的。這種氨基酸序列反復出現于整個主要結構中，形成了蛋白質的二級結構的同質性。這些蛋白質中的這種堅硬而延伸的結構也賦予了它們置換承重材料所必需的力學性能，使它們成為很好的ACL重建支架材料。Altman和 Horan［18］開發了一種用于ACL置換重建的組織工程方法，將絲纖維構建成合股纖維。這種絲纖維是一種分級結構，由一束束繞成股的絲纖維組成，這些絲纖維股又繞成繩，繩又繞成了三維結構。每一級的每一層朝著不同的方向繞。研究表明，這種絲纖維無細胞毒性，有利于細胞增殖。這種支架具有和天然ACL類似的力學性能。其最大載荷為2 000N，張力失效大約為39%，彈性模量350 Mpa。所有的數值均類似于天然ACL實驗得出的數據。這種支架也具有類似韌帶和腱的3個階段的力學性能，支架結構證明了腳趾區域及其后的線性區域。這種特性曲線對防止因疲勞和蠕變造成的支架損傷很重要［19］。在其他一些研究中，Altman和Horan［18］通過用RGD序列覆蓋表層增加了絲纖維的生物適合性和再生能力，極大增強了骨髓間充質細胞（BMSCs）的細胞附著、細胞增殖和分泌細胞外基質。

2.2 人工合成聚合物 許多人工可降解的高分子材料，已被用于 ACL修復重建研究，常見的有聚乙醇酸（PGA）［20－21］、聚乳酸（PLA）［22］、聚碳酸酯（poly DTE carbonate）［23］、聚己內酯（PCL）［24］、聚乙烯醇（PVA）及其共聚物［25－26］。使用人工合成高分子材料的優點：支架材料來源不受限制，不傳染疾病；支架材料可生物降解，且不引起排斥反應；可以通過改變材料的結晶度、分子量或改變共聚物中各聚合物配比來調節支架材料的力學性能及降解性能。

Cooper等［27］報道了一種復合種子細胞可降解，經3D編織的聚L-乳酸（PLLA）韌帶支架。PLLA已通過美國FDA認證，已有PLLA縫線在臨床應用，PLLA不引起排異反應，可逐漸降解，由正常組織所替代。與自體移植物不同，這些人工聚合物韌帶既不會傳染疾病，也不受來源的限制。這些支架在消毒后不會像天然支架材料那樣，力學性能下降［11］。與早期的人工合成高分子材料制備的人工韌帶（Leeds-Keio韌帶、Kennedy Ligament Augmentation Device）不同，PLLA的抗疲勞性較好。在體內實驗中，支架在降解后被正常組織完全替代。在降解實驗中，PLLA纖維在8周的時間中力學性能只有輕微的改變26。在使用3D編織技術后的支架，在力學性能上與正常韌帶相近。支架使用編織技術后，抗磨損和抗斷裂的性能得到提高。支架的整體結構得到加強，從而避免了因部分纖維的斷裂導致整個支架重建的失敗。編織增加了支架的孔隙率和孔通率，關節腔的營養物質可以進入支架內，增加了細胞的附著面積，促進了細胞的增殖和組織的長入。此外，這種支架結構由一種纖維狀、層次結構、支架由類似正常韌帶膠原纖維直徑的微細纖維絲組成。這些微細纖維絲組成一束纖維，纖維排列成束經編織后貫穿于整個支架。編織后的支架分為3部分：脛骨端、韌帶部分（關節腔內部分）、股骨端。骨端和關節內部分（韌帶）的孔徑是不同的，有研究表明骨組織長入的最小孔徑為150μm，而軟組織長入的最小孔徑為200～250μm。因此，不同的孔徑促進了不同部位、相應的組織和毛細血管的長入［28］。

2.3 生物組織 由生物組織制備的移植物存在組織來源的隱患。最主要的隱患包括潛在疾病傳播、不良的免疫反應和細菌感染。正如前面所說，對這些移植物進行殺菌消毒而不改變它們的力學特性也是很困難的。其優點使用時不需要在患者身上二次手術取材。這些移植物對于移植組織的供給是沒有限制的，它們有初始的力學強度（取決于組織的來源）。基于生物組織的移植物也促進了細胞增殖和新組織生長。

最近，異種移植物（動物組織）已經成為了ACL修復的一種新選擇［29］。異種移植物有著和同種異體移植物同樣的優勢和劣勢。它們可能也有把動物身上的疾病傳播給人類宿主的風險以及免疫排異的風險。Stone和Abdel-Motal［30］研究表明處理過的異種移植物可能是ACL修復的一種可行的選擇。在研究中，經過化學改性，來源于克隆豬的移植物被作為ACL替代物。研究成功的使用免疫化學改性和化學交聯處理后的豬移植物移植重建了ACL。

為了防止移植物的排異，ɑ-gal抗原決定部位從移植物中移除。天然抗Gal（anti-Gal）抗體和ɑ-gal抗原決定部位之間的相互作用阻礙了豬組織異種移植的使用。然而，最近缺乏ɑgal抗原決定部位的克隆豬排除了這種障礙。隨著ɑ-gal抗原決定部位的消除，研究中使用的ACL移植物通過脈沖沖洗以去除細胞成分，并和0.10%的戊二醛交聯12h。這樣處理后，用甘氨酸端來阻滯未反應的戊二醛分子，并用17.8kGy放射滅菌。

在體內試驗中，處理后的豬移植物被植入獼猴體內。總共有20只獼猴被用于實驗，實驗觀察期分別是2、6、12個月。3只獼猴被用于2個月的實驗，5只被用于6個月的實驗，5只被用于12個月的實驗。對照組7只獼猴。1只移植未處理的豬異種異體移植物和1只移植獼猴同種異體移植物，為期2個月；5只移植獼猴同種異體移植物，為期12個月。移植物和另一條腿上的完整韌帶通過了6個月（3個移植物）和12個月（10個移植物）的生物力學測試并進行組織學檢查。處理后的豬骨－臏腱－骨移植物和未經處理的冰凍的獼猴骨－臏腱－骨移植物被切成骨－腱構造。這種植入移植物為長30mm、寬4mm（腱材料）的移植物，兩端帶有直徑5mm、長7mm的骨塊。

試驗表明植入物促進了新韌帶組織的再生。有跡象表明移植物重塑是從移植物邊緣擴展到中心。此外，12個月后，豬移植物顯示出相當的極限負荷、屈服載荷、強度和極限位移。在6～12個月間，植入處理后移植物的強度從43%增加到了58%。然而不幸的是，移植物也表現出較低數值的極限強度、屈服強度、極限應力和模量。雖然這些最終數值需要進一步完善，但是負荷和移位數值表明這種移植系統正在成為一種ACL置換的可行選擇。伴隨著力學測試也進行了獼猴對豬移植物的排異試驗。血樣分別采集于手術前，第10、14、21、28、42和56天，以及第3、6、9和12個月，分析抗Gal和抗非Gal（anti-non-Gal）抗 體，比 如 豬 移 植 物 中 的 蛋 白 質 抗 體。 用ELISA測定血清免疫球蛋白（Ig）、anti-Gal IgG和IgM活性。在植入手術后2周內，和植入了處理后移植物（比未處理的低95%）的獼猴的anti-Gal濃度相比，植入了未處理豬移植物的獼猴的anti-Gal濃度（＞200%）有了極大的增加。對未處理移植物的強烈反應表明存在急性排斥，會導致移植物的破壞和再吸收。據估計，植入處理后移植物的獼猴的anti-Gal濃度的微增可能是因為對a-gal抗原決定部位的一種免疫反應，a-gal抗原決定部位處于骨－韌帶－骨移植物的松質骨縫隙的豬骨髓細胞。在植入術后8～12周，anti-Gal濃度達到了移植物植入前的數值。在一項專門研究中，豬移植物被植入了人體中作為ACL替代物。通過蛋白質／免疫印跡法和ELISA的實驗證明，人體產生了anti-non-Gal抗體來對抗多樣的豬異種蛋白。抗體產生的水平在2～6個月達到頂峰，在2年后完全停止。沒有產生對抗人體韌帶蛋白的任何抗體。2年后，研究中5／6的患者完全適應了豬移植物的功能。

3 展 望

ACL是復雜和高度有序的組織，它所具有的力學特性對于正常的膝關節運動非常重要。為了在受傷后保持膝關節的功能，重建移植物一方面必須能夠承受適當的負荷，另一方面要在短時期內發揮類似的力學特性，同時促進新的成熟韌帶的生長，以承受長時期的負荷［31］。組織工程韌帶支架可選材料包括天然聚合物、人工聚合物及生物組織。它們都可以滿足制造組織工程移植物的需要，包括結構穩定性和適當的力學強度，細胞和組織生長的促進作用，以及緩慢降解并使新的組織承擔負荷的能力。生物活性和力學穩定性的有機結合使這些移植物成為ACL置換很好的選擇。

［1］ Frobell RB，A randomized trial of treatment for acute anterior cruciate ligament tears［J］.New England J Med，2010，363（4）：331-342.

［2］ Brophy RH，Wright RW，Matava MJ.Cost analysis of converting from single-bundle to double-bundle anterior cruciate ligament reconstruction［J］.Amer J Sports Med，2009，37（4）：683-687.

［3］ 敖英芳，田得祥，崔國慶，等.運動員前交叉韌帶損傷的流行病學研究［J］.體育科學，2000，20（4）：47-49.

［4］ Majewski M，Susanne H，Klaus S.Epidemiology of athletic knee injuries：A 10-year study［J］.Knee，2006，13（3）：184-188.

［5］ 李君芳.人工韌帶重建與膝關節前交叉韌帶的運動損傷［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（12）：2221-2224.

［6］ 吳波，楊柳.前交叉韌帶解剖和生物力學特性［J］.中國矯形外科雜志，2006，14（22）：1725-1726.

［7］ Verdonk，P，Pernin J，Selmi T，et al.Very long term re-sults of anterior cruciate ligament reconstruction combining apatellar tendon graft with extra-articular tenodesis［J］.JBJS（Br），2010，92：329-335.

［8］ Bowers AL，Bedi A，Lipman JD，et al.Comparison of anterior cruciate ligament tunnel position and graft obliquity with transtibial and anteromedial portal femoral tunnel reaming techniques using high-resolution magnetic resonance imaging［J］.Arthroscoy，2011，27（11）：1511-1522.

［9］ Landes S，Nyland J，Elmlinger B，et al.Knee flexor strength after ACL reconstruction：comparison between hamstring autograft，tibialis anterior allograft，and noninjured controls［J］.Knee Surg，Sports Traumatol，Arthrosc，2010，18（3）：317-324.

［10］Sameer HN，Grant GA，Kevin AB，et al.Cost analysis of outpatient anterior cruciate ligament reconstruction：autograft versus allograft［J］.Clin Orthop Rel Res，2010，468（5）：1418-1422.

［11］潘丕春，劉金釗，孫康.γ射線照射與非照射人肌腱生物力學的比較研究［J］.中國矯形外科，2009，17（13）：1010-1012.

［12］Freeman JW，Woods MD，Laurencin CT.Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design［J］.Biomec，2007，40（9）：2029-2036.

［13］Bernardino S.ACL prosthesis：any promise for the future［J］.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2010，18（6）：797-804.

［14］Barber-Westin SD，Noyes FR.Factors used to determine return to unrestricted sports activities after anterior cruciate ligament reconstruction［J］.J Arthroscopic ＆ Related Surg，2011，27（12）：1697-1705.

［15］陳益果，丁晶，徐永清等.膝關節前交叉韌帶損傷治療進展［J］.西南軍醫，2010，12（1）：84-86.

［16］Robayo LM，Moulin VJ，Tremblay P，et al.New ligament healing model based on tissue‐engineered collagen scaffolds［J］.Wound Repair Regen，2011，19（1）：38-48.

［17］Fan H，Liu H，Toh SL，et al，Anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold in large animal model［J］.Biomaterials，2009，30（28）：4967-4977.

［18］Altman GH，Horan RL.Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments［J］.Biomaterials，2002，23（20）：4131-4141.

［19］Stone KR，Walgenbach AW，Turek TJ，et al.Anterior cruciate ligament reconstruction with a porcine xenograft：A serologic，histologic，and biomechanical study in primates［J］.Arthroscopy，2007，23（4）：411-419.

［20］Drogset JO，Straume LG，Bj?rkmo I，et al.A prospective randomized study of ACL-reconstructions using bone-patellar tendon-bone grafts fixed with bioabsorbable or met al interference screws［J］.Knee Surg，Sports Traumatol，Arthrosc，2011，19（5）：753-759.

［21］BI Lee，JH Yoo.Delayed foreign body reaction due to bio-absorbable pins used for femoral fixation in anterior cruciate ligament reconstruction［J］.Ame J Sports Med，2010，38（1）：176-180.

［22］George Z.Papageorgiou，Theodore B，et al.Crystallization and enzymatic hydrolysis of PLA grade for orthopedics［J］.Advances in Polymer Technology，2010，29（4）：280-289.

［23］Antti JA，Mika P，Jukka N，et al.In vivo degradation of poly（DTE carbonate）membranes.Analysis of the tissue reactions and mechanical properties［J］.J Mater Sci：Mater Med，2008，19（1）：53-58.

［24］Shao HJ，Lee YT，Chen CS，et al.Modulation of gene expression and collagen production of anterior cruciate ligament cells through cell shape changes on polycaprolactone／chitosan blends［J］.Biomaterials，2010，31（17）：4695-4705.

［25］Smith IO，Ma PX.Biomimetic scaffolds in tissue engineering［J］.Tissue Engineering，2011，1：31-39.

［26］蔡長儐，王富友，楊柳，等.I型膠原／聚乙烯醇共聚紡絲的生物相容性研究［J］.第三軍醫大學學報，2011，33（20）：2107-2111.

［27］Cooper JA，Lu HH，Ko FK，et al.Fiberbased tissue-engineered scaffold for ligament replacement：Design considerations and in vitro evaluation［J］.Biomaterials，2005，26（13）：1523-1532.

［28］Cooper JA，Sahota JS，Gorum WJ，et al.Biomimetic tissue-engineered anterior cruciate ligament replacement［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（9）：3049-3054.

［29］冷元曦，林月秋，阮默，等.肌腱移植材料的研究進展［J］.中國矯形外科，2009，17（22）：1704-1706.

［30］Stone KR，Abdel-Motal UM.Replacement of human anterior cruciate ligaments with pig ligaments：A model for anti-non-gal antibody response in long-term xenotransplantation［J］.Transplantation，2007，83（2）：211-219.

［31］Joseph W.Freeman，Tissue engineered devices for ligament repair，replacement and regeneration［J］.Afri J Biotechnol，2009，8（25）：7182-7189.