內質網應激中未折疊蛋白反應與非酒精性脂肪性肝病的研究進展＊

王 軍 綜述，陳東風 審校

（第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所消化內科，重慶400042）

內質網（endoplasmic reticulum，ER）是真核細胞中重要的細胞器，它是由封閉的膜系統和膜圍成的腔，形成互相溝通的三維網狀結構。早在1945年，由Porter等學者在對培養的小鼠成纖維細胞進行電鏡觀察時發現并命名。它是蛋白質合成、折疊、組裝、運輸和細胞內鈣儲存的主要場所，同時參與脂質代謝和類固醇激素的合成。鈣離子穩態的改變和未折疊或錯誤折疊蛋白質在內質網內的蓄積可以引發內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS是細胞的一種自我保護機制，主要表現為蛋白質合成暫停、未折疊或錯誤折疊蛋白表達（UPR）和細胞凋亡等。

非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）是一種與胰島素抵抗（IR）和遺傳易感性密切相關的代謝應激性肝臟損害，其病理學改變與酒精性肝病（ALD）相似，但患者無過量飲酒史，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相關肝硬化和肝細胞癌。NAFLD發病機制至今尚未完全明確，Day和James［1］提出的“二次打擊”學說已成為解釋該病發生機制的主要理論。初次打擊主要指IR和脂質代謝紊亂所導致的肝細胞內脂質沉積，形成單純性脂肪肝。二次打擊主要指各種原因所致的氧化應激及脂質過氧化損傷，引起NASH。國內外相關研究顯示，ERS與NAFLD的發生、發展密切相關，現將ERS與NAFLD的關系綜述如下。

1 ERS及其誘發因素

當新合成的蛋白質N末端糖基化、二硫鍵形成以及蛋白質由內質網向高爾基體轉運等過程受阻時，非折疊或錯誤折疊的新合成的蛋白質在內質網中大量堆積，或者是Ca2＋平衡狀態的打破，都會損傷內質網的正常生理功能，稱為ERS。根據誘發因素，ERS分為3種類型：（1）未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）；（2）正確折疊的蛋白質在內質網腔內過度蓄積激活細胞核因子κB（NF－κB）引發的內質網超負荷反應（endoplasmic reticulum－overload response，EOR）；（3）固醇調節級聯反應。其中UPR與EOR是由蛋白質加工紊亂所致，后者則是在內質網表面合成的膽固醇損耗所致［2］。

2 未折疊蛋白反應

內質網應激發生初期，細胞通過改變其轉錄和翻譯過程，減少蛋白的合成，降低進入內質網的蛋白量，同時上調內質網中分子伴侶和折疊蛋白的表達，增強內質網的蛋白折疊功能；細胞還可以通過上調內質網蛋白降解途徑的相關基因表達，加速未折疊蛋白的降解過程。內質網產生的這種適應性反應，即UPR。這是一種在進化過程中保留下來、相對保守的應答，對機體具有保護作用。

蛋白質的正確折疊需要內質網中蛋白質分子的參與。其中主要有3類分子伴侶和折疊蛋白：熱休克蛋白家族（HSP）的葡萄糖調節蛋白GRP78；外源凝集素類的鈣聯接蛋白（CNX）和鈣網織蛋白（CRT）；蛋白二硫化物異構酶家族中的巰基氧化還原酶。這些伴侶蛋白能快速與轉運入內質網管腔的新合成蛋白結合，參與新蛋白的折疊、寡聚化、成熟等翻譯后修飾過程。其中葡萄糖調節蛋白GRP78在UPR過程中發揮了關鍵作用。GRP78又稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白（binding immunoglobulin heavy chain protein，BIP）。應激時，GRP78／BIP表達上調作用明顯，所以是ERS和UPR激活的標志蛋白。

典型的未折疊蛋白信號途徑：UPR需要3種內質網定位蛋白參與：肌醇需要跨膜蛋白激酶和核酸內切酶1α（IRE1α）、雙鏈RNA依賴蛋白激酶樣ER激酶（PERK）和活化轉錄因子6（ATF6）。以上3種應激感受蛋白都是內質網中的跨膜蛋白，都有各自的內質網腔結構域檢測未折疊蛋白［3］。非ERS時，IRE1α、PERK和ATF6分別與GRP78／BIP結合處于不活躍階段；應激時，GRP78／BIP從上述3種膜蛋白上解離，內質網腔中的未折疊蛋白聚集，導致細胞質內結構域二聚化，游離的IRE1α、PERK分別通過自身磷酸化而被激活。游離的ATF6進入高爾基體，通過蛋白酶水解成為活性轉錄因子［4］。上述分子伴侶表達上調可繼續輔助未折疊蛋白的折疊，蛋白質折疊成原始的構象，經過修飾最終成為具有活性的功能性蛋白質。只有正確折疊的蛋白質，才能分泌進入高爾基體。如仍未正確折疊，則可進入細胞質中經泛素－蛋白酶體降解，這個過程稱內質網相關降解（ERAD）。適度的內質網應激反應有利于細胞在各種外界因素的刺激下恢復細胞穩定，維持生存；過度或者持續應激則會啟動細胞凋亡程序。

3 未折疊蛋白反應與NAFLD發生的關聯通路

3.1 IRE1α－XBP1途徑 IRE1α一個內切核糖核酸酶，通過非常規剪接XBP1信使RNA，激活 X－盒結合蛋白－1（XBP1），產生轉錄的UPR原件和內質網應激反應原件基因，控制ERAD和分子伴侶。IRE1α也降解信使RNA的許多分泌和跨膜蛋白，幫助減少進入ER的過載蛋白［5］。IRE1α介導酵母同源物ATF／CREB1（HAC1）mRNA剪接生成 HAC1p；IRE1α介導哺乳動物XBP1mRNA剪接生成XBP1s。下游途徑中IRE1α激活靶點包括HAC1p和XBP1s［6］，同時 HAC1p和XBP1s分別是酵母和哺乳動物細胞膜脂質合成的關鍵因素［7－8］。研究證實：在NIH－3T3纖維母細胞中，只有對XBP1s增強表達，才能充分誘導內質網膜中最主要的磷脂成分卵磷脂的合成［9］。為研究小鼠出生后肝臟中XBP1的表達，Lee等［10］學者敲除小鼠表達XBP1的基因，血漿中三酰甘油、膽固醇和游離脂肪酸降低；分析小鼠的原代細胞，發現14碳醋酸生成脂肪酸和固醇類也是降低的，提示XBP1途徑需要脂質更新。在飼養高蔗糖飲食的小鼠模型中，用染色質免疫沉淀法實驗證實，XBP1也能結合生脂基因的啟動子。有研究表明：在小鼠胚胎期3T3－L1纖維母細胞中，IRE1α－XBP1途徑也與脂質合成有著密切的聯系［11］。此外，有學者提出在胰島素抵抗及高胰島素血癥條件下，UPR中IRE1α－XBP1途徑能增加胰島素誘導肝臟脂肪生成能力，胰島素介導的蛋白合成與胰島素介導的生脂過程緊密相連［12］。

3.2 PERK－eIF2α途徑 內質網應激時，PERK蛋白在內質網膜寡聚化，隨即誘導自身磷酸化，激活其激酶活性。募集真核生物起始因子2（eIF2）的α亞單位使eIF2α上的N端第51位絲氨酸磷酸化，導致蛋白質整體翻譯水平弱化。PERK和eIF2α的磷酸化也能出現在脂質合成和脂肪肝的調控中，在小鼠乳腺上皮敲除PERK表達基因，游離脂肪酸減少和導致哺乳期小鼠生長遲緩［13］。eIF2α的磷酸化可以上調ATF4的表達，ATF4能上調CHOP、GADD34等蛋白的表達。有研究表明：ATF4雜合小鼠的表型包括避免年齡和飲食相關誘導肥胖和飲食誘導脂肪肝［14］。有學者利用GADD34的C末端活化碎片，在小鼠肝臟中，研究p－eIF2α信號調控作用［15］。轉基因導致大量代謝性適應：包括在小鼠飼養高脂飲食中的脂質合成的降低。生脂基因核受體的低表達、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）及上游的PPARγ的調控子，CCAAT／增強結合蛋白α和－β（C／EBPα和C／EBPβ）都與脂質合成的減少有關。

3.3 ATF6途徑 ATF6是內質網上Ⅱ型跨膜蛋白，具有內質網腔內、跨膜區和胞質區3個結構域，N端位于胞質，含有一個堿性鋅指結構（bZIP）的DNA轉錄激活功能域，C端位于內質網腔內，具有多個BIP結合位點。在正常狀態下，ATF6和BIP形成穩定的復合物停留在內質網上。在內質網應激時，ER腔內的未折疊蛋白能使BIP和ATF6分離。ATF6以囊泡轉移的方式從內質網膜轉移到高爾基體，在高爾基體內被蛋白酶S1P（site－1protease）和S2P（site－2protease）切割后激活［16］。ATF6和固醇調節原件結合蛋白s（SREBPs）都是內質網膜結合轉錄因子，能通過蛋白水解的分裂作用被激活?，F在已經發現肝臟有3種SREBP：SREBP－1a、SREBP－1c、SREBP－2。其中SREBP－1c在三酰甘油、膽固醇和脂肪酸形成中起著關鍵作用，它能控制脂肪細胞的分化和脂肪在細胞內的異位積聚作用。它能增加乙酰輔酶A合成酶的表達從而啟動脂肪生成，并能抑制線粒體轉運蛋白，促進TG正平衡，減少VLDL合成。肝臟SREBP－2過表達則使所有脂質生成酶的mRNA增加，其中HMCoA還原酶mRNA增加量最明顯，而脂肪酸合成酶（FAS）的mRNA增加幅度相對較少。提示肝內SREBP1c是成脂基因表達的重要調控者。研究證實：核形成的ATF6抑制SREBP2的轉錄活性通過其SREBP2復合物，征募組蛋白HDAC1［17］。因此，UPR 三個重要傳感器，PERK、IRE1α和ATF6α都能調控肝臟中脂質儲存，都能與適當的下游蛋白或DNA相關蛋白結合發生作用。

4 未折疊蛋白反應和NAFLD的疾病進展

越來越多的證據表明，UPR在由NASH、糖尿病等代謝疾病引起的肝損害進展中起著關鍵作用［18］。NASH的肝臟病理學表現包括脂肪變性、炎癥、纖維化、細胞凋亡和壞死［19］。國內外大量研究表明：胰島素激活、氧化應激、細胞因子信號調控途徑、炎癥、細菌內毒素等因素之間相互作用可能與NAFLD進展有關，而UPR對NAFLD進展已有部分研究。

4.1 JNK 肥胖和胰島素抵抗在NAFLD的病理學表現中起著重要的作用［20］。研究表明：肝臟和脂肪組織中的內質網應激在肥胖與胰島素活性退化中起著分子連接作用［21］。肥胖誘導內質網應激通過UPR中IRE1α－JNK活化途徑降低胰島素信號，JNK－介導的胰島素受體基底物（IRS－1）抑制物引起的胰島素抵抗，其能促進肝臟脂肪變性，而同源蛋白3（TRB3）和JNK介導胰島素抵抗能導致高胰島素血癥及肝臟脂肪生成的增加。在蛋氨酸－膽堿飲食喂養小鼠中敲除JNK1，保留JNK2，能降低肝細胞三酰甘油累積、炎癥、肝損害和細胞凋亡［22］。此外，在肝細胞特定基因JNK1的消融表型中，能促進葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗及脂肪肝［23］。因此，UPR中IRE1α介導JNK途徑，可能對NAFLD進展起著重要的作用。

4.2 氧化應激 內質網為蛋白折疊和二硫鍵的形成，提供良好的氧化環境。當氧化的蛋白折疊時，每一個二硫鍵形成生成一個活性氧。據估計分泌細胞每分鐘生成300～600萬個二硫鍵；因此，內質網中的蛋白折疊、活性氧的生成與氧化應激存在密切的聯系［24］。細胞內氧化應激能破壞內質網穩態和誘導內質網應激。研究表明：UPR通過轉錄因子Nrf2能激活抗氧化過程［25］。Nrf2屬于Collar家族亮氨酸拉鏈區轉錄因子，調控可誘導的抗氧化反應。Nrf2在肝臟和腎臟中高度表達，是UPR中PERK的亞基。研究表明：Nrf2刪除導致蛋氨酸膽堿缺乏飲食小鼠中脂肪型肝炎的快速進展［26］。此外，Nrf2缺乏小鼠在內毒素、盲腸結扎、穿刺等因素引起的感染性休克中，死亡率增加［27］。上述研究已經表明：Nrf2可能參與先天免疫反應的調控。正如前面提到的，UPR中PERK介導eIF2α的磷酸化作用也導致ATF4的上調。因此PERK和Nrf2必然有維持細胞內谷胱甘肽水平的作用。由此推出：Nrf2與脂肪性肝炎有直接聯系。除了PERK之外，最近也有證據表明UPR中IRE1α－XBP1途徑也有抗氧化的調控作用［28］。

4.3 內毒素 NASH患者中小腸細菌過度生長，腸源性內毒素血癥、腸黏膜屏障功能減退等腸道環境的改變可能在NASH的發病機制中起重要作用［29］。血清內毒素（LPS）可刺激肝臟產生腫瘤壞死因子（TNF）－α、白細胞介素（IL）－6等細胞因子，誘導炎性反應并引起肝臟壞死。同時，LPS能誘導正常狀態下肝臟的UPR活化及肝臟硬化癥小鼠肝臟中UPR的持續活化［30］。有研究證明，遺傳性肥胖小鼠較無肥胖的對照小鼠，對LPS損傷具有更高的敏感性，在暴露于小劑量LPS下NASH 進展更快［31］。

4.4 細胞凋亡 NASH患者中肝細胞凋亡的增加與疾病嚴重程度有關，因此，細胞凋亡可能是NAFLD進展的組成部分［32］。如果UPR不能改善內質網應激則會導致細胞凋亡。C／EBP同源蛋白（CHOP）是 UPR中重要的促凋亡蛋白。CHOP表達在人和哺乳動物中受ATF4或ATF6調控，CHOP缺失可以避免內質網應激誘導的細胞凋亡。CHOP缺失在Akita小鼠中內質網應激介導糖尿病和膽汁淤積誘導的肝纖維化的衰減中表達延遲［33］。但是，NAFLD中CHOP的作用機制還不清楚，但最近有研究表明：在CHOP敲除小鼠中，蛋氨酸膽堿缺乏飲食沒有誘導出肝損害［34］。

綜上所述，NAFLD脂質來源包括飲食中乳糜顆粒殘余物、釋放脂肪組織中三酰甘油的游離脂肪酸以及新合成的脂肪組織。而ERS中的UPR途徑與脂質合成的調控密切相關，且UPR嚴重度及其持續性與內質網應激密切相關，UPR能通過ERS快速重建或維持內質網穩態，從而抑制脂肪肝的發生。盡管如此，迄今為止對UPR信號通路的細節還不明確，還存在很多問題，比如UPR是如何從保護細胞生存反應轉變為促凋亡反應，最終導致細胞死亡。UPR過程中是否還有一些未知的信號轉導蛋白，而已知信號轉導蛋白是否存在其它未知底物。另外，應該怎樣設計UPR信號通路不同元件的基因缺陷動物模型，弄清各種疾病的發病機制，值得深入研究。

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