苜蓿植株再生體系研究進展

許來俊，王成章，嚴學兵，張森浩，李 佳

(河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州 450002)

苜蓿(Medicagosativa)是目前世界上栽培歷史最悠久、分布最廣泛的多年生豆科牧草。因其具有營養豐富、適口性好、蛋白質含量高和易于消化等特點，確立了其作為優質草畜飼料獨一無二的地位，并享有“牧草之王”的美譽，長期以來在畜牧業生產中發揮著重要作用[1]。

隨著西部退耕還林還草戰略的實施，在高產優質的前提下，篩選并選育抗鹽堿、抗旱、抗寒、耐貧瘠的苜蓿品種已成為主要目標。就育種而言，除了傳統的育種手段，利用基因工程技術來培育新品種已成為一種重要手段，而苜蓿組織培養可以說是利用基因工程技術進行基因改良和新品種選育的基礎，只有建立了穩定、高頻的再生體系，才能構建較好的轉化體系，提高轉化效率，獲得轉基因植株，進而獲得改良新品種。因此，利用各種再生體系建立體細胞無性變異系或利用基因工程技術對其產量、品質、抗病性等方面進行改良，將為牧草生產做出重要貢獻。70年代初，國外就從苜蓿的愈傷組織成功誘導出了植株。Saunders和Bingham[2]通過器官形成和體胚愈傷組織發育兩條途徑，最終成功分化出完整的苜蓿植株，標志著苜蓿再生體系研究的開始。1981年，上海植物生理生態研究所楊燮榮等[3]在國內首次利用紫花苜蓿葉片、葉柄、莖段成功誘導出了愈傷組織，并獲得了再生植株。至此，國內關于紫花苜蓿再生體系的研究拉開了帷幕。經過30年的研究，苜蓿植株再生體系的建立已取得了較大的進展，現將其基本技術的研究進展及所遇到的問題進行簡單綜述。

1 苜蓿的植株再生途徑

1.1直接分化芽再生途徑 直接分化芽再生途徑是指外植體細胞不經過脫分化階段形成愈傷組織，而直接分化出不定芽進而獲得再生植株。該途徑轉化頻率較低，易產生嵌合體，但再生周期短、遺傳變異小，尤其是莖尖分生組織細胞遺傳穩定性非常好。目前以植物的幼莖、胚軸、葉片、莖尖和子葉為外植體，直接分化再生體系的建立已有很多成功的例子[4]。1988年McCabe等[5]用基因槍轉化大豆(Glycinemax)莖尖成功獲得了轉基因植株。苜蓿葉片、花莖、花序、莖段等外植體可在添加適當BA和NAA的MS培養基上直接成苗，成苗率達30%～70%[6]。

1.2愈傷組織再生途徑 愈傷組織再生途徑是指外植體先經過脫分化培養形成愈傷組織，然后經過再分化形成再生植株。該途徑是苜蓿組織培養及快繁的主要方式，具有以下特點：1)外植體取材范圍廣，苜蓿的多種器官及組織均能實現再生。很多研究發現，采用不同的外植體進行愈傷組織誘導及再分化，均能得到再生植株，但再生頻率有很大差別，這與基因型及外植體種類、培養基的成分等的不同有關[7]。2)擴繁量大，轉化率高。3)嵌合體多，且隨著組織培養繼代延長，嵌合體比例增加。4)遺傳變異大，不穩定。因此，對于優良苜蓿品種采用愈傷組織再生途徑快繁時，應該注意對再生植株進行遺傳學和形態學方面的鑒定，以保持種子的遺傳穩定性。

1.3原生質體再生途徑 植物的原生質體是去掉細胞壁后的“裸露”細胞，具有細胞的全能性。原生質體再生途徑即通過分離原生質體，進行原生質體培養，由此再分化出再生植株，它是改變植物遺傳品質的主要方法和手段[8]。 用于原生質體培養的材料一般為再生性強的器官或組織，或具再生潛力的懸浮細胞系和胚性愈傷組織。

1980年Kao和Michayluk[9]利用苜蓿的葉肉分離原生質體并誘導形成再生苗，苜蓿同一品種不同單株分離出的原生質體在胚狀體形成及分裂頻率上有差異。1994年白靜仁等[10]利用15～20日齡的野生黃花苜蓿(M.polymorpha)葉肉原生質體成功獲得了再生植株。Santos等[11]利用30～35日齡的苜蓿幼苗的葉片來分離原生質體并形成再生植株，但是當苗齡超過35日齡時，由葉片分離的原生質體則不能分裂。黃紹興等[12]利用保定苜蓿(M.sativacv.Baoding)的根的原生質體成功獲得再生植株。劉明志[13]利用大葉紫花苜蓿下胚軸誘導的愈傷組織原生質體形成小愈傷組織，進一步形成體細胞胚并最終發育成完整植株。Gilmour等[14-15]將M.sativa的原生質體分別和M.quasifalcata、M.falcata、M.borealis等的原生質體融合，并獲得愈傷組織。

1.4胚狀體途徑 在組織培養的離體條件下，任何體細胞均可誘導植物胚胎的發生。在功能和形態結構上類似于有性胚的結構被稱為胚狀體或體細胞胚，它在一定的培養條件下可以發育成完整的植物體。胚狀體的誘導和發育是植物細胞具有全能性的最可信的證明，由此而建立的再生體系也是最為理想的基因遺傳轉化的受體系統[16]。其優點是嵌合體較少、轉化率高、遺傳性一致。

李聰等[17]對22個苜蓿品種的子葉進行體細胞胚的誘導，魚雷狀胚誘導成苗率最高可達74%。李望豐等[18]通過添加不同濃度的2,4-D對12個苜蓿品種的根的誘導的研究，篩選出來體胚發生能力和分化率均較高且對2,4-D敏感的品種，進一步完善了胚狀體再生體系。王強龍等[19]研究得出最佳的體細胞胚誘導和分化培養基為SH培養基，并建立了紫花苜蓿體細胞胚的高頻再生體系。

2 苜蓿再生體系的研究

2.1品種基因型的選擇 品種基因型是影響植物體細胞胚發生的關鍵因素，相同物種的不同基因型之間體細胞胚胎發生能力存在很大差異[20]。Sairam等[21]的研究表明，苜蓿的再生能力受基因型控制且高度遺傳，可以通過輪回選擇法來提高植株的再生能力。Cerasela等[22]利用羅馬尼亞的3個苜蓿品種Topaz、Coral、Super來研究不同類型的外植體產生愈傷組織的能力,初步研究表明苜蓿的組織培養對基因型有很強的依賴性。Chen等[23]對3個不同栽培品系的50個不同基因型苜蓿的由愈傷培養形成體細胞胚和再生植株的能力進行比較，結果表明苜蓿的基因型與其再生能力是密切相關的，具有較高再生能力的基因型形成體細胞胚能力對培養基及外植體的來源依賴性低，而其他基因型的品種則只能用特定的外植體或者在合適的培養基上才能分化形成體細胞胚。Monteiro等[24]在研究5個不同品種的苜蓿原生質體培養時發現，雖然當子葉或葉片作為外植體時都能誘導產生愈傷組織，但只有品種Rangelander的葉片可以分化出體細胞胚，并獲得再生植株。李聰等[17]曾對22個國內外不同基因型的紫花苜蓿做了再生試驗，并在國內首次研究了不同基因型對苜蓿體細胞胚形成的影響。試驗表明，不同基因型品種在分化苗的能力上存在著很大的差異。徐春波等[25]用4個紫花苜蓿品種中苜 1號、公農1號、獵人河和WL-323獲得高頻再生體系，研究了基因型對紫花苜蓿脫分化和再分化的影響。結果表明，WL-323的愈傷組織分化率最高達到76.3%,為最佳基因型。

2.2外植體的選擇 外植體是由活植物體上切取下來以進行培養的那部分組織或器官。近些年來，國內外研究報道中所采用的外植體種類繁多，幾乎苜蓿所有組織或器官都可以作為外植體，如幼芽、下胚軸、子葉、莖尖、花粉、莖段、上胚軸、葉片、葉柄、根、花藥等。研究者發現，對于同一植物不同部位的組織細胞來說，其脫分化和再分化的能力會因其生理狀態或植株年齡不同而呈現出差異，因此選擇合適的外植體也是決定苜蓿組織培養成功與否的關鍵因素。

一些試驗結果表明葉柄是最佳的外植體。Navak和Konecna[26]對不同植株部位原始材料的培養特性研究表明，葉柄的體細胞胚形成能力和再生能力最強。Gallego等[27]利用葉柄、下胚軸、子葉和葉片作外植體，試驗結果也認為葉柄是最好的外植體，平均產生18個體細胞胚，且有8%的體細胞胚可形成再生植株。

另一些學者[28-31]的研究則表明下胚軸是紫花苜蓿愈傷組織誘導的最佳外植體。王強龍等[19]在試驗中發現，紫花苜蓿同一品種內不同外植體間的愈傷組織誘導率差異很明顯，其誘導率排序為下胚軸>葉柄>子葉>葉片，而Scarpa等[32]在對一年生黃花苜蓿的胚性愈傷組織誘導中同樣發現下胚軸>根>葉柄和子葉節>葉片。王涌鑫等[33]在對保定苜蓿的再生體系的研究中發現下胚軸比子葉具有更短的愈傷組織誘導時間、更高的誘導率和更高的胚狀體分化率，并認為它是苜蓿組織培養首選的外植體。

張靜妮等[34]對3個紫花苜蓿品種(秘魯、關中、甘農3號)及2個雜花苜蓿(M.varia)品種(甘農1號、甘農2號)的不同外植體的愈傷誘導率進行研究，得出在葉柄、子葉節、子葉、葉片這4種外植體中，子葉節是誘導愈傷的最佳外植體材料。鄭寶仁等[35]的研究選用子葉節為外植體，建立了從種子萌發到馴化移栽僅需8周的苜蓿子葉節離體培養體系。

趙金梅等[36]以真葉為外植體，在 MS+0.2 mg ·L-12，4- D+0.01 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1KT 培養基上進行愈傷組織的誘導，誘導率可達100%，愈傷組織誘導繼代2～3次，然后在MS培養基上分化，分化率可達90%，將形成的苗轉入1/2 MS培養基進行生根，形成完整的再生苗。

羅馬尼亞學者Cerasela 等[22]分別利用葉片、根、葉柄作為外植體來誘導愈傷，結果表明，根是愈傷誘導的最佳外植體。Iantcheva等[37]利用雜花苜蓿品種R108的根作外植體，根先用1 mol·L-1蔗糖溶液預處理48和72 h，然后在液體培養基中培養。結果表明，預處理72 h的根完成再生所用時間最短(55 d)，體胚形成再生植株的比例最大(70%)。

張明娟和王曉萍[38]的研究得出幼葉有利于誘導愈傷組織，而帶有腋芽的莖段有利于誘導再生芽，可根據不同的目的選擇不同的組織部位作為外植體來進行培養。Ziauddin等[39]用苜蓿品種RSY27的莖尖作為外植體，在添加1 μmol·L-1IBA的MS培養基上離體培養，得到了再生植株。陳愛萍等[40]以小孢子發育處于單核靠邊期的苜蓿花藥為材料，研究培養方法、花藥接種密度以及谷氨酰胺對苜蓿花藥愈傷組織誘導的影響，來提高苜蓿花藥的培養效率。

從前人的研究可以看出，對于不同的基因型和不同的試驗目的來說，最適合的外植體是不同的，應針對具體情況來篩選合適的培養基。

2.3基本培養基的選擇 在很大程度上，培養基成分制約著離體培養物的形態發生和組織生長。雖然植物組織培養對營養物質的基本需要類似于完整植株，但實際上在實驗室條件下不同物種之間組織培養所需要的營養成分變化很大[41]，所以應根據實際情況來選擇合適的培養基。國內外文獻中報道的對苜蓿愈傷組織和胚狀體進行誘導的不同組合培養基有多種。

Shao等[42]對比了2種簡單、快速、有效的苜蓿轉化再生體系。第1個再生體系采用的是MSH系統，即葉片先在含2,4-D和KT的MS培養基上培養，然后繼代到不含生長調節劑的MS培養基上。第2個再生體系采用的是Bh5系統。兩個系統誘導的體細胞胚都轉移到Boi2Y培養基(Blaydes培養基+100 mg·L-1肌醇+2 g·L-1酵母提取物)上誘導體細胞胚分化。Boi2Y培養基的使用對縮短再生時間和提高體胚成苗率、胚分化成苗率非常重要。結果表明，MSH系統上10～14周可得到轉化植株，而B5h系統則需要12～16周。王強龍等[19]的研究卻表明，在MS、MSO、Boi2Y和SH 分別作為苜蓿體細胞胚誘導培養基時，除了Boi2Y培養基不能形成體細胞胚，其余3種培養基均能成功形成體細胞胚，而SH培養基的體胚的分化率明顯高于其他培養基。Cheyne和Dale[43]以莖尖分生組織為材料利用B5培養基成功分化出再生植株。舒文華等[44]專門對B5培養基和MS培養基作了比較，結果表明，采用B5培養基的大量元素配合MS培養基的其他成分有利于苜蓿胚軸愈傷組織的誘導，同時也利于分化出苗。

很多研究表明，MS培養基是苜蓿培養的適合培養基。張靜妮等[34]以秘魯、關中、甘農3號3份紫花苜蓿品種及甘農1號、2號2份雜花苜蓿品種為試驗材料，來研究WPM、MS、N6、SH、B5這5種不同培養基對愈傷組織誘導的影響，且培養基中分別添加2，4-D 2.0 mg·L-1和蔗糖30 g·L-1。結果表明，MS是紫花、雜花苜蓿品種的最佳愈傷組織誘導培養基。Kenichi 和Tadashi[45]研究了31個苜蓿品種的體細胞胚發生能力，發現在MS培養基上有14個品種具有體胚發生能力，而在SH培養基上只有3個品種具有體胚發生能力。宮相忠和黃健[46]的研究結果表明MS培養基有利于苜蓿愈傷組織的誘導，而SH培養基則更適合于愈傷組織的分化。時永杰和周麗霞[47]將供試的幾種豆科牧草在MS、N6、B5等培養基上均誘導產生了愈傷組織，其中以MS培養基上形成的愈傷組織質量最好、數量最多、增殖最迅速。

2.4植物生長調節物質 植物組織培養的發展方向在很大程度上是由基本培養基中的植物生長調節物質的種類、濃度以及不同生長調節物質之間的比例配置等所決定的。苜蓿組織培養中常用的生長調節物質主要有2類，即生長素類和細胞分裂素類。生長素和細胞分裂素在培養基中的比值大小對組織培養體系的形態發生十分重要，它決定了外植體發育或分化的方向[6]。

2,4-D已經在很多試驗中被用作牧草類植物進行組織培養時的生長素[48-49]。一般情況下，生長素(2,4-D的質量濃度在1～3 mg·L-1)對于誘導外植體形成愈傷組織是必需的[50]。Saunders和Bingham[2]的研究表明，紫花苜蓿愈傷組織的誘導需要高濃度的2,4-D,而體細胞胚的形成階段則必須降低2,4-D濃度或者不使用2,4-D，否則胚性愈傷會在生長素的持續作用下進入脫分化狀態，不斷產生愈傷組織，最終不能形成成熟的體細胞胚或再生植株。馬伶俐[4]的研究中將2,4-D質量濃度設置為1、2、3、4 mg·L-14個梯度，結果發現隨著濃度的升高，愈傷組織的褐化數量也呈增加趨勢，說明高濃度2,4-D會引起胚性愈傷組織的褐化，且濃度越高褐化越嚴重。李聰等[17]研究認為在 MS培養基上誘導苜蓿愈傷組織的形成時，2，4-D是不可缺少的，且適宜的添加水平為2 mg·L-1，而生長素與細胞分裂素配合使用比單獨使用生長素誘導效果要好。

越來越多的試驗結果顯示，低濃度的細胞分裂素，能夠幫助提高愈傷組織的誘導率[48,51-52]。常用的細胞分裂素為KT和6-BA。王涌鑫[53]的研究表明，在愈傷誘導階段，2,4-D起到了主要作用，KT能輔助2,4-D發揮更好的效果，但是在胚狀體誘導階段，KT可以單獨發揮很好的作用，2,4-D就不再被需要了。在研究不同濃度KT對胚狀體誘導和成熟的影響時，0.2 mg·L-1KT質量濃度對胚狀體的誘導和成熟是最適濃度，高質量濃度的KT(0.4、0.6 mg·L-1)會顯著降低胚狀體誘導率。Walker等[54]研究外源激素對促進幼苗和幼根分化的影響時發現，在高濃度2,4-D、低濃度激動素的誘導培養基上誘導的愈傷組織轉到再生培養基上后能產生大量無菌苗。李望豐等[18]的研究表明，SH中添加2,4-D 50 μmol·L-1和KT 5 μmol·L-1可產生具有高度再生能力的胚性愈傷組織，不加生長調節物質則有利于再生。梁慧敏等[55]試驗指出誘導中苜1號葉片外植體愈傷組織需較高濃度的2,4-D，BA的效果優于KT和ZT，最佳的愈傷誘導培養基為改良SH+4.0 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA。Bai和Qu[56]在對草坪型酥油草(Festucaovina)的研究中也發現6-BA能明顯提高愈傷組織的再生能力。但是馬伶俐[4]在研究不同2,4-D、6-BA濃度配比對愈傷組織誘導的影響中卻發現，6-BA濃度越高形成正常狀態的愈傷組織越少，6-BA濃度越低則形成正常狀態的愈傷組織越多，即兩者成反比。并認為6-BA的存在抑制誘導愈傷，在誘導苜蓿愈傷組織形成的過程中不宜加入6-BA。

2.5其他添加物的應用 國內外的研究人員認為，在體胚形成過程中加入脯氨酸、AgNO3等對苜蓿體胚形成有一定的作用。Stuart[57-58]研究了苜蓿組織培養過程中氨基酸的作用，認為加入氨基酸對苜蓿體胚形成有一定的影響。在SH培養基中加入50～300 mmol·L-1的脯氨酸比不加脯氨酸的對照組體胚生成率高出3倍。Hammad等[59]將愈傷組織轉入30 mmo l·L-1脯氨酸和10 mmo l·L-1NH4NO3的SH再生培養基上，3周后體胚大量產生。Romagnoli[60]試驗中，MS培養基中附加10～20 mmol·L-1NH4和30 mmol·L-1脯氨酸能形成大量體胚。1987年，Meijer和Brown[61]研究表明，在體胚誘導和分化過程中銨是必不可少的,誘導時最適濃度為5 mmol·L-1，而分化時則宜采用10～20 mmol·L-1的濃度,并認為外源氨基酸對分化不是必需的，甚至常常是起阻遏作用的，除了1或2 g·L-1的水解酪蛋白或者4.4 mmol·L-1谷氨酰胺+3.1 mmol·L-1脯氨酸可以增加體胚數(20%～30%)外。但是Neves等[62]發現添加脯氨酸會增加苜蓿體胚的死亡率。梁慧敏等[63]的試驗認為脯氨酸濃度較低時對分化沒有影響，但當質量濃度超過50 mg·L-1時分化率明顯下降。王強龍等[19]的研究表明，L-脯氨酸對隴東、大葉、甘農1號3個品種的體胚誘導和分化基本沒有影響。從前人的研究可以看出，可能因品種、培養基、試驗條件等方面的差異，脯氨酸對體胚的影響沒有統一的結論。

組織培養是在密封的容器中進行的，植物細胞會產生乙烯，而積累的乙烯對植物器官發生和體細胞胚的形成均有抑制作用，甚至會導致植株的畸形生長和發育。張鵬等[64]研究表明在培養基中添加AgNO3可消除這種情況，認為Ag+可能是通過競爭性結合于細胞膜上的乙烯受體蛋白而抑制乙烯的活性，從而來提高植株再生頻率。徐春波等[25]在對品種WL-323的高頻再生體系研究中發現，最佳繼代培養基為MSO+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1AgNO3，添加適量AgNO3明顯促進了愈傷質量的改善，胚性愈傷率明顯升高。李培英等[65]以MSO為基本培養基，添加2.00 mg·L-1AgNO3使新疆大葉苜蓿的分化率從41.1%增加到63.3%。低濃度的AgNO3可以促進新疆大葉苜蓿的分化，而高濃度下其分化率降低，這可能是高濃度的Ag+破壞植物體內離子平衡，出現離子毒害所致。

蔗糖濃度也對胚狀體的誘導和植株的再生有著顯著影響[66-67]。Meijer 和Brown[61]認為過低或過高的蔗糖濃度都會降低體胚的發生率，3%的質量分數較適宜，但是王強龍等[19]的試驗表明蔗糖質量濃度為20 g·L-1時，胚狀體的誘導率達到最高(78%)。王涌鑫[53]的試驗認為高濃度的蔗糖有助于愈傷組織和胚狀體的誘導和成熟，但是對于生根是不利的，在愈傷組織和胚狀體的誘導、成熟階段，培養基中添加30 g·L-1的蔗糖，而在生根階段，1/2 MS培養基內添加15 g·L-1的蔗糖比較合適。

翟桂玉等[68]對幾種復合添加物質(如水解酪蛋白、酵母提取物、胨、椰乳、馬鈴薯勻漿汁)進行了比較，發現這幾種復合添加物對體細胞胚的發生均有明顯促進作用，其中以胨的效果最好，酵母提取物次之。此外梁慧敏等[63]和馬海燕等[69]均發現谷胱甘肽(GSH)作為一種含硫化合物，可降低愈傷組織的褐化程度，在15 mg·L-1時可顯著促進胚狀體的分化。

3 其他方面的研究

除了品種、培養基等方面的影響，一些學者還研究了光照對苜蓿再生的影響。時永杰和周麗霞[47]試驗表明在暗培養的條件下雖然也能產生愈傷組織，但是愈傷數量少，質量差，分化率低。毛雅妮等[70]研究光照對苜蓿愈傷組織誘導及體胚發生的影響，結果發現光暗交替條件下誘導的愈傷組織體細胞胚發生率高于暗條件下誘導的愈傷組織體細胞胚發生率。李聰等[17]在對22個苜蓿品種再生體系研究過程中采用3 000 lx的連續光照也取得試驗成功。所以關于光照的控制，應根據組織培養的整個體系的情況來綜合考慮。

在微觀方面，宮相忠和黃健[46]在顯微鏡下的觀察表明，體細胞胚起源于單個的胚性細胞，它既能在愈傷表面發生，又可在其內部發生。體細胞胚經過球形期、心形期、魚雷期及子葉期各階段可形成再生植株。王友生等[71]的研究卻發現在同一塊愈傷組織上往往同時存在各個時期的胚狀體(球形期、心形期、魚雷期、子葉期)，這說明胚狀體的產生在時間上有一定的差異。

4 苜蓿再生過程中存在的問題及發展前景

綜合苜蓿植株再生體系的研究現狀，發現存在的問題主要集中在以下幾個方面：

1)再生體系不穩定，可重復性較差。很多試驗由于試驗條件、藥品質量、人為因素等原因在重復后無法得到相同的試驗結果，即使是針對同一品種，不同的研究人員得出的結果也不完全相同。

2)再生周期長，體胚分化率低。從前人的研究情況來看，大部分的再生過程都需要3～5個月。在再生體系的各個條件都較適合的情況下，應對外植體的生長狀況密切觀察，在最適宜的時間轉移到新的培養基上，在最有利于外植體分化出苗的同時盡量縮短再生周期。

3)受基因型影響大。大量研究表明，對于不同品種或同一品種的個體基因型來說，在相同的愈傷誘導培養基和分化培養基的條件下，其愈傷誘導率一般無顯著差異，但是體胚分化率往往差異顯著，而體胚分化率低就大大減少了再生植株的獲得及以后的通過基因轉化成功改良苜蓿性狀的可能性。已有很多學者指出紫花苜蓿的基因型是限制其再生能力的最大因子[72]。因此，需要擴大試驗范圍，進一步摸索適宜的再生條件，篩選出再生效率高且穩定的材料。

4)關于再生機理的討論很少。只有清楚機理，才能找到解決問題的關鍵點。但目前大部分的工作依舊處在表面探索階段，未對再生機理作深入研究。今后可在體細胞胚的形成以及體胚分化過程中生長素、細胞分裂素等內源激素的含量變化及信號傳導等方面進行研究。

隨著苜蓿植株再生體系更深入、更廣泛的研究，建立再生效率高且穩定的再生體系，將使人們能夠更好地通過生物技術手段來進行品種培育和品種改良，同時在苜蓿作為生物反應器來生產轉基因生物疫苗、工業酶制劑和一些重要的藥用蛋白等方面也能夠得到更好的發展。

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