誘導大麥LEA蛋白的抗旱基因及Eibi1基因研究進展

周元成 董雙全

(山西省農業科學院小麥研究所，山西 臨汾 041000)

干旱脅迫是作物生產的主要非生物逆境之一，它嚴重影響農作物的品質、產量和栽培范圍。通過挖掘作物自身的抗旱、耐旱機理，以科學的手段和方法培育優良的耐旱作物品種是從根本上解決這一問題的有效途徑。大麥具有早熟、耐旱、耐鹽堿、抗黃矮病等多種優良性狀，本文主要介紹大麥耐旱基因即HVA1基因、HDCS1基因、脫水素 (DHNs)、角質層基因Eibi1的結構、功能及其誘導和表達，同時簡述大麥抗旱基因在轉基因育種工程中的應用，并對大麥抗旱遺傳育種的發展提出建議。

1 大麥抗旱基因的結構和功能

1.1 脫水素 (DHNs)的結構和功能

LEA蛋白即高等植物胚胎發育晚期豐富蛋白(Late embryo.genesis abundant proteins，LEA proteins)是種子發育后期產生的一類小分子特異多肽。有研究表明，LEA蛋白可在細胞層面上保護植物免受干旱脅迫損傷。脫水素 (Dehydrins，DHNs)是一類水溶性脂質聯合體蛋白，屬于第2組LEA蛋白 (LEA D-11)，其共同特征是C-端富含賴氨酸，由15個氨基酸組成的保守序列，即EKKGIMDKIKEKLPG(也稱K.片段);通常N端有一保守基序Y-片段，二者之間還有一可被磷酸化、由6個絲氨酸串聯的S-片段。Egerton-Warburton LM等通過免疫學檢測發現脫水素在細胞核和細胞質中都有分布，這與其他LEA蛋白是不同的。Danyluk等通過對小麥的膜系統的研究，認為脫水素對逆境脅迫保護膜系統穩定性至關重要［1］。Compbell［2-3］等總結前人經驗，根據氨基酸序列特征推測了脫水素的生物學功能: (1)在非生物逆境脅迫細胞失水情況下，維持植物細胞內膜系統的結構穩定性，(2)細胞失水滲透壓增高時，細胞內多余的游離離子將被吸附，減小離子對植物細胞的傷害;(3)和其他功能蛋白結合，在干旱脅迫下維持其他蛋白質的正常結構和功能，保證植物正常生理代謝功能的繼續。目前在大麥基因組中已描述DHN基因達13個，推測于大麥耐旱相關最為緊密的脫水素基因為DHN4、DHN6。經測定，DHN4位于大麥的第6H染色體上，DHN6位于4H染色體上。DHN4為YSK2型脫水素，其編碼區長為678 bp，二級結構易形成 a-螺旋，通過SWISS-PROT預測DHN4的三級結構，結果顯示它并沒有固定的三維結構，這使DHN4能更易于與生物膜結合從而穩定生物膜，防止細胞內水分的過度流失，維持膜結構的水合保護體系，防止膜脂雙分子間距減小，進而阻止膜融合以及生物膜結構的破壞［1，4］。杜俊波等［5］用 RT-PCR 的方法從青稞中克隆到了脫水素基因DHN4，且通過實驗驗證了這一觀點，并由此推斷DHN4在青稞的抗旱能力方面起到了重要的作用;DHN6基因序列全長為1767 bp，含一個92 bp內含子，90～1759 bp為一個開放閱讀框，編碼523個氨基酸殘基的多肽，預測蛋白質的分子量為49.68 kDa，理論等電點為8.04。結構分析發現，DHN6具有3個螺旋區，無規則卷曲構成二級結構的主要組分，親水氨基酸比例超過83%;三維結構預測發現，多肽鏈自身反向平行排列成松散的親水索鏈，K片段參與兼性。螺旋結構域的形成，意味著該脫水素具有束縛自由水、穩定細胞膜相結構的功能。實時定量RT-PCR檢測結果表明，DHN6基因的相對表達水平在干旱處理8 h快速累積，推測DHN6在大麥對干旱脅迫的早期響應中發揮重要功能［6］。

1.2 HVA1基因的結構和功能

目前國內外眾多學者對大麥HVA1基因的表達與調控、高同源性序列的克隆以及轉HVA1基因植物抗旱性功能驗證等方面開展了深入廣泛的研究。大麥HVA1基因所編碼的蛋白屬于Lea蛋白的第3組，有研究證明，第3組LEA蛋白在種子成熟，干燥和滲透脅迫條件下可保護細胞免受水勢降低的損傷。HVA 1基因位于大麥的第5條染色體上，編碼區全長642 bp，含213個氨基酸殘基的蛋白質，富含Ala、Thr、Lys。HVA 1編碼的蛋白質包括9個重復的不完整的11個氨基酸組成的保守基元序列:Thr-Glu-Ala-Lys-Gln-Lys-Ala-Ala-Glu-Thr。其上游啟動子區域含有在ABA誘導基因中保守的序列元件:三個pABRE序列和C盒。研究發現，C盒和 pABRE 1突變不會影響HVA1基因的轉錄水平，高水平HVA1基因的表達依賴于 pABRE 2 和 pABRE 3［7］。

1.3 HDCS1基因的結構和功能

二棱大麥HDCS1基因編碼202個氨基酸，含有8個由11個氨基酸殘基組成的基序列。與大麥HVA1基因屬高同源性序列。將它們的核苷酸序列及其所編碼的蛋白質氨基酸序列進行同源性分析。結果顯示，HDCS1的664個核苷酸殘基與HVA1相比，HDCS1缺少了C339-C431的33個核苷酸，同樣也缺少相應的Thr122-Ala132的11個氨基酸殘基，這11個氨基酸是一個完整的基元序列。也就是說HDCS1比HVA1僅缺少一個基元序列，其他部分完全相同。HDCS1基元序列呈α-螺旋結構，具有親水親脂兼性，根據第3組LEA蛋白的結構特征及HDCS1的結構，可以推斷HDCS1是形成第3組LEA蛋白高級結構的基礎［8］。

1.4 角質層基因Eibi1

陳國雄等［9］，以野生大麥和水稻為試驗材料，克隆角質層基因Eibi1，該基因與葉片角質層保水功能密切相關。角質層基因Eibi1編碼ABCG全轉運子，把角質成分從細胞內運轉到葉片表面形成功能性角質層。Eibi1基因編碼ABC轉運蛋白G亞家族的一個全轉運子HvABCG31，DNA序列全長l1693 bp，位于大麥染色體3H上，其表達主要出現在苗期伸長區的幼葉組織中。角質層基因Eibi1的抗旱機理與前文所述基因有所不同，它主要是調節葉片表面角質層的厚薄來完成抗旱脅迫功能的。其調節機理如下:Eibi1基因功能的缺失會導致葉片表皮細胞中脂質成分的大量積累.葉片表面角質層變薄，角質含量減少，同時角質層結構不完整，葉片失水快，保水抗旱能力差。

2 大麥抗旱基因誘導與表達

研究顯示，HVA 1基因的表達與多種因素有關。在種子發育期間，HVA1基因的mRNA在糊粉層及開花25 d的胚中積累，在干種子的糊粉層中保持較高水平，而在淀粉質胚乳細胞里未檢測到。這說明HVA1基因的表達受種子發育水平的調節。大麥種子在休眠和未休眠的狀態下，HVA1 mRNA在干胚里的含量是相同的，但吸脹后，休眠胚HVA1 mRNA下降的速度比未休眠的要慢，打破種子休眠，則導致HVA 1mRNA的消失。這說明休眠和水份都對HVA1基因的表達有調控作用。另外，HVA 1基因的表達還受干旱、NaC1、寒冷或熱處理及ABA等誘導表達。如Bimei Hong(1992)等人干旱處理24 h或冷處理4 d后HVA1的轉錄有很大的提高，但熱處理4 h或1%NaC1處理3 d后轉錄水平僅有少量增強［7］。

脫水素 (DHNs)基因的表達受干旱、NaC1、脫落酸 (ABA)、赤霉素 (GA)、水楊酸 (SA)、茉莉酸 (JA)、傷害、紫外線、重金屬、光周期等因素的調控［10］。有研究表明，脫水素的表達累積水平隨著環境脅迫的時間延長而升高。如錢剛等(2011)［6］通過實驗證實大麥Dhn6基因的轉錄水平隨著干旱脅迫時間的延長升高。也有研究證明，在大麥發現13個脫水素中，并非所有的脫水素基因都被干旱脅迫誘導表達［11］，Tommasini等［12］發現大麥脫水素 Dhnl、Dhn2、Dhn3、Dhn4、Dhn7、Dhn9和Dhnl0受干旱脅迫后在胚芽，中胚軸和種子根部的表達量上調，但不受低溫脅迫;Dhn5、Dhn8和Dhnl3受干旱和低溫脅迫的誘導;Dhn6、Dhnl1和Dhnl2既不受干旱也不受低溫脅迫的誘導，它們主要在胚胎中表達。Choi等發現Dhnl2基因只在種子發育成熟過程中特異表達，而且，隨著干旱脅迫時間的延長。同時有研究表明，即使相同的LEA蛋白基因在抗旱性不同的大麥參試材料中的表達累積也有所不同［13-14］，Suprunova等［15］在測定了大麥離體葉片失水率的基礎上，檢測了脫水素的早期轉錄累積水平，發現脫水素在抗旱性不同的大麥材料表達累積也存在差異。這些結果都說明不同的脫水素在應對植物干旱脅迫時應答機制并不相同，這可能是由于基因的順式作用元件不同而引起的差異。

3 抗旱基因工程育種

HVA1基因具有較強的抗旱功能，在農業生產中有非常廣泛的應用價值。自1988年Bimei Hong等人發表大麥HVA 1基因cDNA序列的文章發表以來，國內外眾多學者根據大麥HVA1基因的cDNA序列克隆出其它作物中與其同源性較強的序列，或者把大麥HVA1基因轉入其它作物獲得抗旱的轉基因植株。除比較早的Deping Xu(1996)、Sivamani(2000)等人通過轉基因技術獲得了轉基因植株外，近幾年，冀俊麗 (2002)、劉祥久等(2005)、李楠等 (2007)也都用不同的技術方法相繼獲得了轉基因株系［7，16］，并得到了一定的抗旱效果。國外也有人將HVA 1基因的cDNA導入到燕麥中，從而獲得了耐旱、耐鹽的轉基因燕麥。

二棱大麥 HDCS1的基因、大麥 DHN4和DHN6基因以及角質層基因Eibi1三個抗旱基因方面，由于研究開展較晚，且一些抗旱機理尚不明確或處在推測階段，它們的轉基因利用還未見報道。

4 展望

提高大麥對干旱、低溫、鹽堿等非生物脅迫的抗性，改良其對環境的適應性，一直是大麥育種工作的一項艱巨任務。大麥抗旱基因的發現與研究對大麥育種工作意義重大，利用分子遺傳育種技術和轉基因技術，可以獲得抗旱性較強、品質較好的大麥品種，大大改善大麥對環境不利因素的耐受性，使其可以在干旱的環境下良好地生長，從而提高大麥的產量和播種面積。但從目前大麥抗旱基因研究上看，仍存在很多不足之處，如大麥脫水素的具體功能和作用機理還沒有統一的認識;角質層基因Eibi1基因也是新近才發現，其功能和作用的研究也都是起步階段;大麥抗旱基因在近緣種屬間的遺傳改良和基因誘導、表達等方面的研究還需不斷深入。隨著大麥抗旱基因研究的發展，以及植物抗旱分子機制的研究和生物技術的日臻完善，大麥抗旱基因將得到更深層次的開發和利用，為抗旱基因工程的研究提供有力的平臺，也必將為獲得高效的抗旱植株、解決干旱脅迫等問題帶來新的希望。

［1］Danyluk J，Pe-on A，Houde M，Limin A，Fowler B，Benhamou N，Sarhan F.Accumulation of an acidic dehydrin in the vicinity of the plasma membrane during cold acclimation of wheat［J］.Plant Cell，1998，10(4):623-638

［2］Compbell SA，Close TJ.Dehydrins:genes，proteins，and associated with phenotypic traits ［J］.New Phytol，1997，137(1):61-74

［3］Porcel R，Azcón R，Ruiz-Lozano JM.Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins(LEA D-11)during drought stress in arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativa plants ［J］.J Exp Bot，2005，56(417):1933-1942

［4］孫 歆，雷 韜，袁 澍，等.脫水素研究進展［J］.武漢植物學研究，2005，23(3):299

［5］杜俊波，席德慧，王尚英，等.青稞脫水素基因Dhn4的克隆與原核表達 ［J］.四川大學學報 (自然科學版)，2008，45(2):441-445

［6］錢 剛，平軍嬌，張珍，等.大麥Dhn6基因的克隆、蛋白質結構預測與干旱脅迫表達模式 ［J］.遺傳HEREDITAS(Beijing)，2011.33(3):270-277

［7］李 楠，趙玉錦，趙 琦，等.大麥HVA 1基因和LEA蛋白與植物抗旱性的研究 ［J］.生物技術通報，2006(4):25-29

［8］郭衛東，饒景萍，徐 炎，李嘉瑞，鄭學勤.二棱大麥LEA cDNA的克隆與測序 ［J］.西北植物學報，1999，19(3):371-375

［9］陳國雄等.野生大麥角質層基因Eibi1的克隆及其抗旱機理研究獲進展 ［J］.廣東農業科學，2011，14:123

［10］邢 鑫，劉 洋，李德全.植物脫水素的結構和功能［J］.植物生理學通訊，2010.346(3):268-276

［11］Choi D W，Koag M.C，Close T.J.Map locations of barley Dhn genes determined by gene-specific PCR［J］.Theoretical and Applied Genetics，2000，101(3):350-354

［12］Tommasini L，Svensson J T，Rodriguez E M，et a1.Dehydtin geneexpression provides an indicator of low temperature and droughtstress:transcriptome-based analysis of Barley(Hordeum vulgare L.) ［J］.Funct Integr Genomics，2008，8:387-405

［13］Guo PG，Baum M，Grando S，Ceccarelli S，Bai GH，Li RH，Korff M V，Varshney RK，Graner A，Valkoun J.Differentially expressed genes between drought-tolerant and drought-sensitive barley genotypes in response to drought stress during the reproductive stage ［J］.J Exp Bot，2009，60(12):3531-3544

［14］Qian G，Han ZX，Zhao T，Deng GB，Pan ZF，Yu MQ.Genotypic variability in sequence and expression of HVA1gene in Tibetan hulless barley，Hordeum vulgare ssp.vulgare，associated with resistance to water deficit［J］.Aust JAgr Res，2007，58(5):425-431

［15］Suprunova T，Krugman T，Fahima L Chen G，Shams I，Korol A，Nevo E.Differential expression of dehydrin genes in wild barley，Hordeum spontaneum，associated with resistance to water deficit［J］.Plant Cell Environ，2004，27(10):1297-1308

［16］李 楠，趙 琦，黃 靜，等.六棱大麥HVA1基因在煙草中遺傳轉化的研究 ［J］.生物技術通報2007，3