牦牛乳脂肪球膜組成分析及蛋白熱穩定性

何勝華，馬 鶯，崔艷華，李海梅，董愛軍

(哈爾濱工業大學 食品科學與工程學院，150090 哈爾濱)

乳脂肪球(MFG)以一種微小的球狀物存在于奶中，直徑約0.2 ～15.0 μm［1］，外面被一層很薄的膜包圍，這層膜稱為乳脂肪球膜(MFGM)［2］.MFGM中含有25% ～60%的蛋白質，這些蛋白質在其他奶相中含量很少，MFGM中蛋白質占奶中總蛋白的 1% ～2%［3］.通過聚丙烯凝膠電泳(SDS－PAGE)分離牛奶MFGM中蛋白質，會出現7 ～8 條主要的蛋白帶［4］，如黏蛋白(MUC1)、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XDH/XO)、過碘酸稀夫Ⅲ(PASⅢ)、過碘酸稀夫Ⅳ(PASⅣ)、嗜乳脂蛋白(BTN)、過碘酸稀夫6/7(PAS6/7)和GTP結合蛋白(GTPrS).近幾年，MFGM原料作為一種有價值的成分應用于食品加工新技術中，MFGM蛋白的功能特性引起廣泛興趣，特別是有報道稱MFGM蛋白有抗癌、防止幽門螺桿菌的感染和對腦脊髓炎的自身免疫作用［5－8］.但是奶加工的一些過程，如常見的冷卻、加熱和均質都會很大程度地破壞MFGM蛋白的穩定性，其中加熱是奶加工的一個關鍵過程，因此，研究熱處理對MFGM蛋白的穩定性尤其重要.我國在MFGM方面的研究還處在初級階段，對奶MFGM的分離和組成及MFGM蛋白的熱穩定性幾乎沒有報道.

牦牛乳含有較高的脂肪(5% ～8%)，而且脂肪球粒徑較大(4.39 μm)，很適合分離奶油及MFGM.本文主要從牦牛乳脂肪中提取分離MFGM，通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecylsulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)確定牦牛MFGM中的主要蛋白、組成及其熱穩定性，并對牦牛MFGM蛋白的氨基酸組成進行分析.

1 實驗

1.1 實驗材料

麥洼牦牛奶:采自四川紅原縣;鄰苯二胺(OPD):北京索萊寶科技有限公司;唾液酸(N－乙酰神經氨酸)標準品(購自sigma).

1.2 實驗設備

Agilent 1100型高效液相色譜儀，配備四元梯度泵，100位自動進樣器，二極管陣列檢測器(DAD)，化學工作站，離心機.日立835－50型氨基酸分析儀.電泳儀:DYY－8C，北京六一儀器廠.

1.3 實驗方法

1.3.1 牦牛奶MFGM的分離提取

取新鮮牦牛乳，向每100 mL牦牛乳中加入蔗糖5 g，于42℃用小型乳脂分離機分離出奶油，將分離出的奶油不經洗滌和用1.5 g·L－1的KCl于小型乳脂分離機中洗滌3次并收集奶油，洗滌的目的是去除附著于脂肪上的酪蛋白和乳清蛋白，洗后和未洗的奶油于4℃冷藏12 h后于42℃溶解，溶解后的奶油用攪拌器攪乳10 min，加少量去離子水，分離出黃油和酪乳.分離出的黃油于60℃加熱融化，然后加入等體積的去離子水，形成的漿液在4 kr/min離心15 min，收集上清液并與酪乳混合，用0.01 mol/L的HCl將上述合并液調至 pH4.8于室溫(25℃)凈置30 min使MFGM蛋白沉淀，于4 kr/min離心15 min收集沉淀物和懸浮的MFGM小體，向收集物中加蒸餾水并用0.01 mol/L的NaOH調至pH6.8.純化后的MFGM儲存于－20℃，待分析.

1.3.2 牦牛MFGM透射電鏡

將分離提純的MFGM用戊二醛在4℃固定在2.5 h以上，然后用0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS)pH7.2清洗3次，每次15 min，洗滌后用1%鋨酸固定1.5 h，接著用0.1 mol/L PBS pH7.2再清洗3次，每次15 min，洗滌后分別用體積分數為50%、70%、90%的乙醇梯度脫水15 min，最后用100%乙醇脫水兩次，每次10 min.用100%乙醇與100%丙酮(體積比為1∶1)繼續脫水10 min后，再用100%丙酮脫水10 min，接著用100%丙酮與 812樹脂(體積比為 1∶1)包埋30 min，再用100%丙酮與812樹脂(體積比為1∶2)包埋2 h，梯度聚合3 d后，修塊、切成厚度為60 nm的小塊，電鏡雙重染色后進行觀察.

1.3.3 牦牛MFGM的成分分析

牦牛MFGM的蛋白質含量分析采用凱氏定氮法(AOAC，1974).總脂質含量分析采用文獻［9］方法.己糖含量采用苯酚－硫酸法，參照文獻［10］.唾液酸含量采用高效液相色譜法，色譜條件為:色譜柱，Agilent TC－C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫，35 ℃;流動相，1.0% 四氫呋喃水溶液(含0.2% 磷酸)－乙腈(體積比為92∶8);檢測波長，230 nm;流速，1.0 mL/min;進樣體積，10 μL.

樣品處理:準確稱取1 g牦牛奶MFGM，用濃度為0.1 mol/L的硫酸溶液8 mL水解，在水浴鍋中80℃條件下水解 2 h，取出后冷卻，于4 kr/min離心15 min，取上清液調pH值至4～6，將濾液定容至10 mL，用移液管準確移取2 mL濾液，加入10g/L鄰苯二氨鹽酸鹽溶液(用0.2 mol/L硫酸氫鈉溶液溶解)1 mL，再置于80℃水浴鍋中加熱 30 min，取出后冷卻，經0.45 μm膜過濾后精密吸取上述溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積.以唾液酸標準品作標準曲線，計算出唾液酸的含量;牦牛MFGM灰分含量的測定通過用馬福爐于550℃灼燒完全后質量的變化來計算.

1.3.4 牦牛MFGM蛋白的SDS－PAGE分析

將分離的牦牛MFGM用上樣液稀釋后，取10 μL上樣于15%的SDS-PAGE，電泳槽開始電壓穩定在85 V，進入分離膠后電壓穩定在120 V，分離的蛋白用考馬斯亮蘭染色1 h，然后用脫色液(V(冰乙酸)∶V(無水乙醇)∶V(水)=100∶50∶850)進行脫色，最后經凝膠成像獲得MFGM蛋白分離圖.

1.3.5 牦牛MFGM蛋白的熱穩定性

新鮮的牦牛奶脂肪經KCl洗滌1次后分別在40、50、60、70 和80 ℃加熱 15 min，冷卻至室溫后按照1.3.1的方法提取分離牦牛MFGM，在提取過程中不再需要用KCl洗滌脂肪，目的是觀察牦牛MFGM蛋白和牦牛乳中酪蛋白和乳清蛋白的相互作用.以不加熱為對照組.分離的MFGM蛋白進行SDS－PAGE(質量分數分別為15%的濃縮膠和5%的分離膠)分析.

1.3.6 牦牛乳MFGM的氨基酸分析

應用日立835－50型氨基酸分析儀附可見光檢測器進行氨基酸的測定.色譜條件:分析柱為150 mm，Φ4.0不銹鋼柱(2169#樹脂);去氨柱，120 mm，Φ4.0不銹鋼柱(2150#樹脂).泵1流速為0.55 mL/min(壓力為90～140 kg/cm2);柱溫58℃，反應盤溫度100℃.采用外標法進行定量.樣品制備采取蛋白質保護性氧化酸水解法.

2 結果與討論

2.1 牦牛MFGM的分離及透射電鏡

MFGM的分離主要有物理和化學分離兩種方法，物理方法主要是分離的乳脂肪經過KCl洗滌后，通過反復的冷凍和溶解，最后通過攪打使MFGM從MFG上脫落并釋放出來進入水相，再通過沉淀和高速離心收集MFGM.化學方法是通過利用極性對質子惰性溶劑、膽汁鹽或非離子型洗滌劑使MFGM直接釋放出來.但是直接提取可導致MFGM得率偏低，另外應用化學物質的濃度、提取的時間和溫度也可以造成MFGM組分在一定程度上發生變化.

圖1是牦牛乳脂肪洗滌前和洗滌后分離的MFGM蛋白的 SDS-PAGE圖.可以看出，牦牛MFGM蛋白主要由一些分子質量較大的蛋白(47.8～225.6 ku)組成，主要有 5種:黏蛋白(MUC1)，分子質量為225.6 ku，該蛋白的分子質量在牛奶、羊奶和牦牛奶中存在一些差別，不同品種的奶MFGM，該蛋白的分子質量可能不一樣，但其范圍在170～225 ku;黃嘌呤脫氫酶(XO)，分子質量為157.4 ku，該物質有較強的抑菌作用;過碘酸稀夫III/IV的分子質量為78～98 ku，模糊的PAS III/IV蛋白條帶顯示了較低的濃度，主要是PAS III/IV蛋白與 MFGM結合較松，而且是MFGM的外圍蛋白，很容易被KCl溶液洗滌下來而損失掉;嗜乳脂蛋白(BUT)，分子質量為67.5 ku、類似的蛋白在母乳中也被分離和發現，分子質量在67～70 ku.過碘酸稀夫6(PAS6)和過碘酸稀夫7(PAS7)，分子質量分別為50.2 ku和47.8 ku.

本實驗對牦牛MFGM的分離采用物理分離法，圖1(a)，(b)是MFGM在分離之前未經過KCl洗滌脂肪和經過KCl洗滌脂肪3次后的MFGM蛋白的SDS-PAGE圖.可以看出，未經過KCl洗滌脂肪分離的MFGM含有大量的酪蛋白，而經過KCl洗滌3次后的MFGM的酪蛋白含量明顯減少.但是與MFGM結合較松的過碘酸稀夫Ⅲ(PASⅢ)和過碘酸稀夫Ⅳ(PASⅣ)經過KCl洗滌后含量有所下降.因此，KCl溶液洗滌3次比較合適.

圖1 牦牛乳脂肪洗滌前后分離的MFGM聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖2是牦牛MFGM的透射電鏡圖(TEM)，可以看出，MFGM片段是折疊的和無規則的，在MFGM上還是結合了一部分酪蛋白膠束，雖然這種結合看起來是簡單的物理結合，但酪蛋白也有可能與MFGM通過化學方法相互結合在一起.

圖2 牦牛MFGM的透射電鏡

2.2 牦牛乳MFGM的基本組成

牦牛MFGM的基本化學組成見表1，主要由蛋白質和脂類兩大物質組成，其MFGM(干基)蛋白質質量分數為(0.27±0.01)g/g，脂質為(0.70±0.05)g/g，這兩種物質占MFGM總質量分數的97.27%，這一結果與Kanno和 Kim報道的牛奶MFGM中的蛋白(28%)和脂質(64%)的質量分數基本一致［11］.另外，牦牛奶 MFGM(干基)還含有(0.10±0.03)mg/g的己糖、(0.005±0.010)g/g的唾液酸和(0.006±0.010)g/g的灰分，其中唾液酸是一族神經氨酸(neuraminic acid)的衍生物，在腦的發育和維護細胞膜、膜受體以及亞細胞器的正常生理功能中起到重要作用［12］.它參與細胞表面的多種生理功能，促進嬰兒的記憶力和智力發育.大量的唾液酸存在于腦神經節苷酯中，也有一些存在于外神經系組織和體液中.記憶形成研究表明腦神經節苷酯中的唾液酸在信息的傳遞和儲藏方面起著關鍵的作用［13］.另外，唾液酸是構成細胞膜黏液素、糖蛋白和糖脂的主要成分.

表1 牦牛MFGM的基本化學組成

2.3 牦牛MFGM蛋白的熱穩定性

加熱是奶加工過程中的一個很重要的環節，有必要研究熱對牦牛MFGM蛋白穩定性的影響.牦牛奶脂肪經KCl洗滌1次后經不同溫度加熱后分離的MFGM蛋白的SDS－PAGE見圖3.可以看出，當加熱溫度達60℃時，MFGM蛋白特別是黃嘌呤氧化酶(XO)、過碘酸稀夫6(PAS6)和過碘酸稀夫 7(PAS7)損失較大.過碘酸稀夫6(PAS6)和過碘酸稀夫7(PAS7)似乎遷移進入乳清中，但這種遷移機制至今不很清楚.可能是β－乳球蛋白和牦牛MFGM的復雜性改變了膜的結構和環境，導致 PAS6和 PAS7的遷移和損失［14］.這種相對較溫和的溫度導致牦牛MFGM蛋白的損失還有待研究，然而，這種作用在40℃就能發生，原因可能是脂質相的熔點在大于40℃后導致脂肪球表面結構發生變化，使得MFGM蛋白損失［15］.

從圖3還可以看出，β－乳球蛋白在60℃沒有損失，濃度反而有所增加，這主要是β-乳球蛋白與MFGM發生了結合.該結合溫度低于β－乳球蛋白的解鏈溫度(78℃)，β－乳球蛋白與牦牛奶MFGM結合的機制還不很清楚，但這里似乎存在一些可能的途徑.據牛奶 β－乳球蛋白與MFGM結合的文獻可以推斷出牦牛奶β－乳球蛋白與牦牛MFGM的結合可能通過巰基與二硫鍵的相互結合，或許是通過直接競爭或MFGM在加熱過程中被破壞，留下了空隙使乳清蛋白吸附到新暴露的脂肪球表面而使得β－乳球蛋白的濃度不斷增加［16－17］.

同樣，圖3也顯示了α－乳白蛋白在60℃也與牦牛MFGM發生了結合.也有一些關于牛奶中α－乳白蛋白與MFGM結合的報道，這種結合的發生同樣可以用來推斷牦牛奶α－乳白蛋白與牦牛MFGM的結合也可能是通過巰基二硫鍵的相互作用，該結合方式與β－乳球蛋白相似，但是牦牛奶中的酪蛋白在整個加熱過程中幾乎沒有發生變化［18］.

圖3 牦牛奶脂肪在不同加熱溫度下分離的MFGM的SDS-PAGE圖

2.4 牦牛MFGM的氨基酸組成

牦牛MFGM的氨基酸組成見表2，列出了牦牛MFGM的15種氨基酸質量分數.其中蛋白質量分數最高的氨基酸是谷氨酸(200.1 mg/g)，其次是亮氨酸(110.8 mg/g)，緊接著是絲氨酸(96.7 mg/g)、賴氨酸(82.6 mg/g)等，牦牛MFGM中的必需氨基酸占整個氨基酸的49.48%.非必需氨基酸占50.52%，兩者之比接近于1.0，說明牦牛乳MFGM蛋白氨基酸組成比例較合理.

表2 牦牛MFGM蛋白的氨基酸組成

3 結論

1)采用物理方法對牦牛MFGM進行分離，KCl溶液洗滌3次效果較好.透射電鏡(TEM)分析表明，MFGM片段是折疊的和無規則的，在MFGM上還是結合了一部分的酪蛋白膠束.

2)牦牛奶MFGM主要由蛋白質和脂類物質組成，其MFGM蛋白質質量分數為(0.27±0.01)g/g，脂質為(0.70±0.04)g/g，另外，牦牛MFGM還含有(0.09±0.02)mg/g的己糖、(0.005±0.010)g/g的唾液酸和0.006±0.010 g/g的灰分.

3)牦牛MFGM蛋白中的黃嘌呤氧化酶(XO)、過碘酸稀夫6(PAS6)和過碘酸稀夫7(PAS7)加熱到60℃損失較大.另外，β－乳球蛋白和α－乳白蛋白在60℃開始與牦牛MFGM結合，隨著溫度升高，結合量不斷增加.

4)牦牛奶中主要的氨基酸是谷氨酸、亮氨酸、絲氨酸、賴氨酸等，其中必需氨基酸占整個氨基酸的49.48%.

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