園藝作物的ISSR分子標記研究及應用

劉淑芹，吳鳳芝，劉守偉

（東北農業大學園藝學院，哈爾濱 150030）

20世紀80年代以來，隨著分子生物學的迅速發展，園藝作物的研究已經不僅僅局限于采用傳統的田間數據測量、植株病蟲害調查、雜交授粉等方法，分子生物學研究方法逐漸被研究者廣泛應用，其中分子標記技術在園藝作物研究中發展十分迅速。近年來，DNA分子標記技術就已廣泛地應用于園藝作物的遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構建、基因定位、品種純度鑒定及分子標記輔助育種等方面，如限制性片段長度多態（RFLP）、隨機擴增多態性（RAPD）、微衛星（Microsatellite）和擴增限制性片段長度多態分析（AFLP）等[1-4]。每種分子標記方法各有優點，但都有其局限性。RAPD技術的引物是隨機序列，操作十分簡單、快速、經濟，但可重復性不夠理想；AFLP技術的多態性和重復性都不錯，但對實驗器材和技術要求稍高，較為復雜和花費更多；SSR技術擁有高度特異性和豐富多態性并且為共顯性標記，但它需要預先知道基因組的序列來設計引物，因此限制了它的應用范圍；ISSR技術的出現克服了這些局限性，并很快被運用到許多植物研究領域[5-6]。

ISSR（Inter-simple sequence repeat）是近年來在微衛星技術上發展起來的一種新型分子標記技術[5,7]。由于ISSR技術不僅可以快速、高效和靈敏地檢測出基因組DNA的多態性，有很好的重復性，而且操作簡單、成本較低，適合大樣本的檢測，在種群遺傳學、種質資源、分類學與種系發生學等方面得到迅速應用[8-10]。本文主要對ISSR標記的原理、方法、特點及其在園藝作物研究中的應用進行綜述。

1 微衛星和ISSR標記

ISSR是在微衛星標記的基礎上發展而來的分子標記技術。以微衛星標記的原理為基礎，隨著獲得微衛星重復單元類型的增加，用微衛星序列直接進行PCR擴增，無需預先知道基因組序列。

1.1 微衛星

微衛星是指以少數幾個核苷酸（1～5個）為單位多次串聯重復的DNA序列，也稱為簡單序列重復（Simple sequence repeats，SSR）或短串連重復（Short tandem repeats，STR）[11]，它在真核基因組中廣泛分布。微衛星主要以2個核苷酸為重復單元，也有一些為3個核苷酸，少數為4個或更多[1]。在對（GT）n、（GA）n、（GATA）n、（GACA）n重復序列進行研究的結果中發現，（GT）n重復序列的拷貝數由酵母的102拷貝到鼠類基因組的105拷貝[13]；而（GATA）n的拷貝數在鼠類基因組中約為104拷貝[14]。一般認為，微衛星的產生是DNA復制或修復過程中DNA滑動和錯配或有絲分裂、減數分裂期姐妹染色單體不均等交換的結果[15]。微衛星具有許多功能，如重組熱點[16]、對基因的調節和表達[14]以及性別決定[17]等。同時微衛星具有高多態性、簡單的孟德爾遺傳方式，能用PCR擴增、提供高質量的信息等優點[18]，近年來已成為比較理想的分子標記方法[6]，廣泛地用于種群遺傳多樣性分析[8]、親子鑒定[19]、遺傳圖譜的構建[20]等方面的研究。

檢測微衛星的多態性，必須獲得所需微衛星位點，即根據已知微衛星位點的兩翼序列設計引物，這可通過查找已知的微衛星引物來實現：篩選與試驗物種親緣關系較近物種的引物以及用經典分子生物學方法克隆所需的微衛星位點[21]。

最近發展了一些無需知道微衛星側翼序列即可檢測有關微衛星高多態性的方法。這是基于對SSR互補引物的使用。它是利用一系列含有簡單序列重復的不同寡核苷酸[5-7]，或者與隨機引物復合使用作為引物[21-23]，對基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物通過聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后，經EB染色、銀染或放射自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態性。這種方法與RAPD技術相似，只用一個引物，但其所用的引物是在SSR的基礎上設計的非錨定引物，如引物可能的序列是（GA）10或（CGG）6，擴增的是SSR之間的DNA序列，又可稱為MP-PCR（Microsatellite primed-PCR）[23]。

1.2 ISSR分子標記技術

ISSR方法是以微衛星重復序列作為引物檢測物種多態性發展而來，即在MP-PCR基礎上發展而來的[5]。該技術在SSR序列的5'或3'末端加上2～4個隨機選擇的核苷酸作為引物，如：5'端的引物為BDDA（CA）7，3'端的引物為（CA）8RY，以引起特定序列位點的退火，降低其他可能靶標退火的數目。該策略的優點是在基因組上只有與錨定的核苷酸匹配的那些位點才能被靶定，因而避免了引物在基因組上的滑動，可提高PCR擴增反應的專一性[24]。這種方法即可對反向排列、長度適中的重復序列間的基因組節段而非重復序列本身進行PCR擴增。ISSR標記通常為顯性標記，擴增反應所用的兩翼引物中，可以是ISSR引物或是隨機引物[23]；如果一個是ISSR引物，另一個是隨機引物，則又稱為隨機擴增微衛星多態性（Random amplified microsatellite polymorphisms，RAMP）[21]?；?SSR 寡核苷酸直接作為引物來擴增基因組DNA的多位點方法，在實驗過程中可由SSR重復單元序列的改變、引物長度不同以及5'和3'末端錨定核苷酸的有無產生擴增模式的不同[21]。擴增產物可以是SSR之間的序列或是SSR之間的序列加上SSR序列，這依賴于不同引物的使用。典型的每個反應每個泳道產生20多條條帶[5]，依賴于不同的物種和引物。ISSR技術在同一塊凝膠中可揭示多基因位點的信息，產生用于多樣性分析和基因圖譜的多態位點標記，該技術提供了一種新的DNA指紋研究方法，可用于分類學與種系發生學的比較以及品種鑒定和種群遺傳學研究，也可作為遺傳連鎖圖譜構建的工具廣泛應用于生物學領域。

2 ISSR分子標記技術的應用

ISSR技術由于引物較長，退火溫度較高，這就增強了實驗的可重復性[6,30]，同時操作簡單、快速、高效，不需要繁瑣的構建文庫、設計引物、雜交、同位素顯示等步驟，而且ISSR標記可以揭示整個基因組的一些特征，并成孟德爾式遺傳[5,7]，因此該技術一問世就在植物遺傳分析中得到廣泛應用。ISSR標記一般是顯性遺傳[5,7]，在譜帶統計和遺傳分析中需引起注意。

2.1 遺傳多樣性分析

由于ISSR技術能提供較大數目的DNA片段，可以掃描基因組內的多態位點，它在生物學中最主要的應用就是分析和評估物種、種群、不同品系、甚至是不同種群的遺傳多樣性[24]。余賢美等采用ISSR標記技術對海南、云南、廣西3省的12個杧果野生居群共265個個體的遺傳多樣性水平及居群遺傳結構進行研究[25]，其中廣西的3個居群(那坡、邕寧、平南)優先與云南的文山居群聚為一支；而云南的永德和版納居群各自聚為一支。Sagar等利用ISSR技術對70個品種的芒果進行遺傳多態性分析，結果發現ISSR技術作為檢測遺傳多樣性是行之有效的方法[26]。何顯靜等對分布于云南境內的紫斑百合（Lilium nepalense）3個居群進行了ISSR分子標記分析，平均有17.85%的遺傳變異來自于居群內，82.15%的遺傳變異來自于個體間，表明居群內存在巨大的遺傳變異，個體雜合程度較高，適應力強[27]。楊若林等用篩選到的12個ISSR引物對我國11個辣椒農家品種進行擴增，結果共擴增出66條譜帶，其中差異條帶26條，多態條帶比率為39.39%；品種特異條帶7條，占總條帶數的10.61%[8]。基于Jaccard遺傳相似性系數的Neighbor Joining聚類分析可以將11個辣椒品種分為兩組，每組所含辣椒品種與聚類分析的結果相同。Talhinhas等應用AFLP，ISSR和RAPD分子標記技術分析羽扇豆（Lupinus polyphyllus）種間和種內的遺傳多樣性，結果檢測到57.00%～78.00%的不相似性，適于研究植物種間遺傳多樣性，表明分子標記技術有助于美國羽扇豆的分類和親緣關系的鑒定[28]。

2.2 品種和種質鑒定

ISSR分子標記技術的快速發展，為品種和種質資源的快速鑒定提供了可能，成功的解決了有效管理、利用物種資源以及對種質的準確鑒定和評估問題。Prevost等僅用4個ISSR引物就可產生大量的多態性條帶，其中兩個最富信息量的引物均能將34個番茄栽培品種區分開，任意兩個引物復合使用均能鑒別所有的栽培品種[29]。Charters等也發現所測試的4個5′端錨定的ISSR引物均能夠區分20個蕓苔和芫菁栽培品種中的16個品種，任意兩個引物的復合使用就能區分所有的20個栽培品種[30]。也有報道表明通過ISSR標記還可區分僅能通過水果品質加以鑒別柑桔的栽培品種[32]，另外，Wolfe等用居群取樣方法在玄參科吊鐘柳屬Pen stemon雜種復合體中得到了10～24個種專一的ISSR標記，清楚地支持了物種P.clevelandi的二倍體雜種起源[31]。

2.3 物種和種群親緣關系研究

ISSR技術也用于種群內、種群間和物種間的研究。Tsumura等采用ISSR方法研究了日本雪松（Cryptomeria japonica）和花旗松（Pseudotsuga menziesii）之間的親緣關系[32]。結果表明，24個ISSR引物有87%～100%左右在這些物種中為多態性引物，但物種間的多樣性無差異；同時還發現，海岸邊的花旗松變種比內陸變種的雜合性高。Fang等用10個SSR引物分析了柑橘35個種之間的親緣關系，可將這35個種分為5個類群，由ISSR標記所得到的分類結果和前人一致[33]。Gulsen等研究表明枸椽對檸檬基因組形成有相當大的貢獻[34]。Isshiki等對20個茄子品種進行遺傳多樣性分析，從100對引物中篩選出34個引物用于茄子的ISSR-PCR，擴增出552個多態性位點，利用這34個引物可以充分的確定茄子的親緣關系[10]。Eiadthong等對13個泰國芒果品種的ISSR分析表明，其中2個品種與其他品種關系較遠，而另外11個品種可分為3個類群[35]。Lanham等對醋栗的ISSR分析表明，醋栗次級基因庫遺傳變異豐富，可運用于早期育種計劃[36]。樹狀圖更忠實地反映了大麥栽培品種間的系統關系。Dávila等用RAMP技術來研究歐洲大麥亞種間的遺傳關系，根據56個ISSR多態性片段，計算亞種間的遺傳距離[37]。結果發現，冬季栽培品種和大麥樣品（Hordeum vulgare ssp.Spontaneum）間的遺傳距離最?。涣硗?，Huang等用ISSR和4個葉綠體DNA非編碼區的限制性位點變異來研究40個甘薯屬（Ipomoea）樣品的遺傳多樣性和種內關系[38]。對比ISSR技術與核基因DNA限制性分析對甘薯屬樣品的檢測結果表明，ISSR技術可檢測到甘薯屬樣本中較多的遺傳變異。

2.4 遺傳圖譜的構建

遺傳圖譜（Genetic map）是指以染色體重組交換率為相對長度單位，以遺傳標記為主體構成的染色體線狀連鎖圖譜。通過構建遺傳圖譜可為基因定位與克隆及基因組結構和功能的研究打下基礎。傳統的遺傳標記技術標記數目少，難以形成較完整的連鎖圖。目前已構建了番茄、馬鈴薯、辣椒、萵苣、甘藍、胡蘿卜、芥菜、豌豆、黃瓜、白菜、芹菜等約20種蔬菜作物遺傳圖譜，其中番茄、馬鈴薯、甘藍等的圖譜已趨于飽和。張仁兵等用西瓜的重組自交系構建了遺傳圖譜，此圖譜包括87個RAPD標記，13個ISSR標記和4個SCAR標記，15個連鎖群[39]。姜帆等以立冬本龍眼DNA為模板研究了龍眼ISSR-PCR反應體系的主要成分對ISSR擴增結果的影響，并探討了構建龍眼指紋圖譜的可行性，利用豐富的多態性DNA譜帶構建了12個基因型龍眼的指紋圖譜[40]。劉威生等在優化的反應條件下建立了5個種12份杏材料的ISSR指紋圖譜[41]。

2.5 基因定位

在蔬菜作物中，許多重要的農藝性狀均表現為質量性狀遺傳，如抗病性、育性等，可利用分子標記進行質量性狀目標基因定位。吳旭紅利用ISSR標記技術獲得了一個與甜菜抗病基因緊密連鎖的ISSR標記ISSR0061，在F2群體分離中符合1∶3的分離比例，有關ISSR標記BA0061-1200抗性基因連鎖的緊密程度還有待今后對F2分離群體進行個體寄主植株的抗病性鑒定和ISSR對應分析研究[42]。吳旭紅用BSA法和ISSR技術對155個隨機引物進行篩選，獲得了一個與甜菜根腐病基因緊密連鎖的ISSR標記OPP0760，可以用作抗根腐病基因的選擇依據[43]。

2.6 輔助選擇育種

在育種實踐中借助分子標記對目標性狀的基因型進行選擇稱為標記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）。目前在黃瓜分子圖譜中發現有較多緊密連鎖的位點，特別是一些形態學基因（F、dm、B、CcU、11）與一些分子標記間存在較緊密的連鎖，可實施標記輔助選擇。Serquen等的研究表明，標記輔助選擇用于主莖長和多側枝形狀的選擇是有效的[44]。Yu等找到了與抗大豆花葉病毒基因（Rsv）緊密連鎖的SSR標記，遺傳距離僅為0.15 cM[45]。可見，通過分子標記輔助選育可以大大提高育種的選擇效率，為開展作物品種資源鑒定和遺傳改良提供了一種快捷手段。

3 ISSR分子標記的展望

ISSR分子標記技術誕生只有短短幾十年，卻得到了廣泛應用，為園藝作物研究開辟了新途徑，更為園藝作物種質資源和品種的鑒定、分類、遺傳圖譜構建及目標性狀基因標記等提供了理想方法。因其引物容易設計、實驗重復性強、操作過程簡單、不須使用同位素的特點，可以揭示更高程度的DNA多態性。因此，ISSR標記在園藝作物研究中具有廣闊的應用前景和巨大潛力。但任何一種分子標記都不能解決所有問題，在今后的研究工作中，應根據不同的研究需要，選擇合適的分子標記，或將不同的標記結合起來進行綜合研究，以提高分子標記的選擇效率。

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