P-選擇素、CD44V6的表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究

黃秀英 唐福興 李鳳玲 齊磊巖 張穎 張素華

乳腺癌是危害女性健康最常見的惡性腫瘤之一，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是危及患者生命的主要原因。P-選擇素是細(xì)胞黏附分子選擇素家族中的重要成員，P-選擇素在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了極為重要的作用。CD44是近年來研究較多的細(xì)胞表面黏附分子，是細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM相互識別和作用的分子基礎(chǔ)［1］。雖然 P-選擇素基因的高表達(dá)、CD44基因的變異型CD44V6的出現(xiàn)提示了惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的傾向。但兩項指標(biāo)在乳腺癌中的表達(dá)及其相互作用關(guān)系的研究筆者還鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料 收集保定市第四醫(yī)院病理科2000年1月至2010年5月手術(shù)切除的蠟塊存檔標(biāo)本93例，患者全部為女性，術(shù)前未接受任何輔助治療，所有病例的臨床及病理資料完整。切除標(biāo)本由2名病理醫(yī)師做出詳細(xì)的病理診斷，包括病灶的大小、病理組織學(xué)類型、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況。其中乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌(DCIS)25例，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)68例，其中48例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;癌旁正常乳腺組織17例(取自距離乳腺癌組織邊緣5 cm以上)作為對照組。

1.2 病理檢查 所有病理標(biāo)本均經(jīng)4%的甲醛液固定，石蠟包埋，常規(guī)制片，HE染色。采用S-P法進(jìn)行P-選擇素、CD44V6二種抗體免疫組織化學(xué)染色，濃縮型兔抗人P-選擇素多克隆抗體，工作液濃度為1∶50，購自武漢博士德公司，即用型鼠抗人CD44V6單克隆抗體，為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。用已知陽性切片做陽性對照，用已知陽性的乳腺癌切片，以PBS代替一抗，作為陰性對照。胞質(zhì)(P-選擇素)及細(xì)胞膜(CD44V6)出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒為陽性，相應(yīng)部位未出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒為陰性。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)［2，3］每張切片選取5個高倍鏡視野，每個高倍視野下隨機(jī)計數(shù)100個細(xì)胞，陽性表達(dá)者呈黃色至棕黃色顆粒，計算出陽性表達(dá)的細(xì)胞所占的百分比。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):著色細(xì)胞＜10%為陰性，≥10%為陽性。著色細(xì)胞為10% ～25%為(+);25% ～50%為(++);＞50%者為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P-選擇素、CD44V6蛋白表達(dá) P-選擇素、CD44V6蛋白陽性標(biāo)記呈黃色或棕黃色顆粒，P-選擇素陽性標(biāo)記位于細(xì)胞漿(圖1、2)，CD44V6 蛋白陽性標(biāo)記位于細(xì)胞膜(圖3、4)。P-選擇素、CD44V6蛋白在DCIS組和IDC組的陽性率和強(qiáng)陽性率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CD44V6在DCIS組的強(qiáng)陽性表達(dá)率明顯低于IDC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 P-選擇素(+++)定位于細(xì)胞質(zhì)(SP×100)

圖2 P-選擇素(+++)在導(dǎo)管原位癌中的表達(dá)(SP×100)

圖3 CD44V6(+++)定位于細(xì)胞膜(SP×400)

圖4 CD44V6(+++)在浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)(SP×40)

表1 P-選擇素、CD44V6蛋白表達(dá)情況 例(%)

2.2 乳腺IDC中P-選擇素、CD44V6蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 P-選擇素、CD44V6蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及不同分化程度間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 乳腺IDC中P-選擇素、CD44V6蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系例(%)

2.3 P-選擇素與CD44V6蛋白表達(dá)的相關(guān)性 P-選擇素呈陽性表達(dá)的83例乳腺癌中有74例CD44V6呈陽性表達(dá);P-選擇素呈陰性表達(dá)的10例中有6例CD44V6也呈陰性表達(dá)。兩者存在明顯的正相關(guān)(χ2=15.942，r=0.414，P＜0.01)。

3 討論

P-選擇素屬選擇素家族的重要成員，亦稱 P-選擇蛋白、CD62P、顆粒膜蛋白140(granule membrane protein，GMP-140)或血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白(platelet activation dependent granule external membrane protein，PADGEM)。P-選擇素是一種由789個氨基酸殘基構(gòu)成的相對分子質(zhì)量為140KD的跨膜糖蛋白。其染色體定位于1q21-24［4］，其結(jié)構(gòu)可以分為5個區(qū)域:(1)3個區(qū)域共同構(gòu)成了N末端的胞外區(qū)，即1個凝集素樣區(qū)、一個表皮生長因子樣區(qū)和9個補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白重復(fù)單位。(2)C末端的24個氨基酸組成跨膜區(qū)。(3)35個氨基酸組成胞漿短尾區(qū)，P-選擇素的胞外凝集素樣區(qū)域是識別并結(jié)合其相應(yīng)的配體的功能部位［5］。

P-選擇素在靜息狀態(tài)下存在于血小板的α顆粒及內(nèi)皮細(xì)胞的W-P小體中，其表面無P-選擇素表達(dá)或呈持續(xù)低表達(dá)狀態(tài)。在病理情況下，血小板及內(nèi)皮細(xì)胞被某些成分(如LPS、組胺、血栓素、過氧化物、蛋白激酶 C、補(bǔ)體系統(tǒng)、ADP、TNF-α、ILlβ、LPS、TNF-α等)刺激而激活，P-選擇素可出現(xiàn)異常表達(dá)。選擇素有很多種配體，P-選擇素能與其配體PSGL-1呈高親和力結(jié)合，有報道不同階段的黑色素瘤患者血漿中P-選擇素均高于正常人，且與病情發(fā)展呈正相關(guān)［6］。Nair等［7］在食道癌患者的血漿中也檢測出P-選擇素的含量是升高的。Iwamura等［8］首先發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞(SUIT-2)中有P-選擇素的表達(dá)，P-選擇素的高表達(dá)還出現(xiàn)在胃癌、腎癌、肺癌、膠質(zhì)瘤及卵巢惡性腫瘤中。Renkonen等［9］發(fā)現(xiàn)乳腺癌原發(fā)灶的癌細(xì)胞P-選擇素的表達(dá)明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞的表達(dá)。Fox等［10］也發(fā)現(xiàn)P-選擇素在浸潤性乳腺癌組織中的表達(dá)是增強(qiáng)的。Peeters等［11］注意到P-選擇素的高表達(dá)也與結(jié)腸直腸癌的惡性程度有關(guān)。周同等［12］在60例胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)P-選擇素的過度表達(dá)與其分化程度無關(guān)系;與腎癌、卵巢惡性腫瘤的組織學(xué)類型無關(guān);與胃癌、腎癌、肺癌、膠質(zhì)瘤及卵巢惡性腫瘤患者的性別及發(fā)病年齡也無關(guān);Caine等［13］發(fā)現(xiàn)乳腺癌特別是伴有轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的血小板黏附性增高，此改變與P-選擇素有關(guān)。且P-選擇素單抗對腫瘤轉(zhuǎn)移有抑制作用。結(jié)合我們的實(shí)驗與上述報道發(fā)現(xiàn)，P-選擇素基因過度表達(dá)的現(xiàn)象出現(xiàn)于多種組織和類型的惡性腫瘤中，P-選擇素的過表達(dá)可能與乳腺癌的演進(jìn)有關(guān)。乳腺癌P-選擇素基因呈現(xiàn)異常表達(dá)的亞克隆細(xì)胞群，通過其自身表達(dá)P-選擇素而上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板P-選擇素的異常高表達(dá)，從而在癌細(xì)胞與脈管間出現(xiàn)雙重介導(dǎo)作用。最終導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，也使臨床TNM分期增高。提示P-選擇素有可能成為較好的具有高轉(zhuǎn)移傾向的乳腺癌預(yù)測指標(biāo)和術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測指標(biāo)。

人類CD44基因是由Dalchau等［14］于1980年用單克隆抗體技術(shù)檢測并最先發(fā)現(xiàn)，該基因定位于11號染色體短臂上(11P13)，CD44分子分2類:(1)標(biāo)準(zhǔn)型CD44(CD44S)，僅由組成型外顯子編碼而成，其分子量為80～90 kDa。(2)變異型CD44(CD44V)，目前已發(fā)現(xiàn)有十幾種CD44V。這種不同的拼接方式使得其分子量范圍較大80～230 kDa。CD44基因是黏附分子家族成員之一，其編碼的產(chǎn)物是由胞外、跨膜及胞質(zhì)3個部分構(gòu)成的跨膜糖蛋白，胞膜外區(qū)是CD44分子發(fā)揮生物學(xué)功能的重要結(jié)構(gòu)。其主要功能:(1)參與淋巴細(xì)胞的激活，調(diào)節(jié)免疫功能。參與細(xì)胞間、細(xì)胞與ECM的黏附;(2)介導(dǎo)淋巴細(xì)胞在血液和淋巴液間運(yùn)行、并將淋巴細(xì)胞歸還到淋巴組織(淋巴細(xì)胞歸巢)，故CD44又稱歸巢受體;(3)參與免疫調(diào)節(jié)，以及淋巴細(xì)胞的激活過程;(4)能夠與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞的偽足形成及遷移運(yùn)動;(5)CD44可在不同水平被調(diào)節(jié)，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

Hofmann等［15］用Notherm印跡法研究了多個體外培養(yǎng)的人癌細(xì)胞系，在肺癌、膀胱癌、食道癌、乳腺癌、腎癌、肝癌、宮頸癌和非何杰金淋巴瘤、結(jié)腸癌等中發(fā)現(xiàn)有CD44V表達(dá)。Sinn等［16］研究表明，CD44V6表達(dá)與大鼠乳腺癌組織學(xué)分級有關(guān)。Liu等［17］應(yīng)用免疫組化檢查了胃腺癌和結(jié)腸直腸腺癌各62例，發(fā)現(xiàn)CD44V6與對照組相比只在癌組織中表達(dá)，CD44V6的高表達(dá)與病理分級、浸潤程度有關(guān)。Yamamichi等［18］進(jìn)一步對CD44在多種臟器惡性腫瘤的研究認(rèn)為CD44V5、CD44V6的表達(dá)與腫瘤進(jìn)展程度關(guān)系密切。Matsumura等［19］在1992年首次應(yīng)用雜交法證實(shí)乳腺癌組織中CD44過表達(dá)，認(rèn)為CD44表達(dá)與乳腺癌預(yù)后有關(guān)。結(jié)果顯示，CD44V6在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌與導(dǎo)管浸潤癌的蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)，隨著CD44V6的蛋白表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)管內(nèi)癌的侵襲能力增加而演變成導(dǎo)管浸潤癌。我們的結(jié)果支持了CD44V6與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)的結(jié)論。CD44V6的表達(dá)與乳腺癌原發(fā)灶的大小和患病年齡無關(guān)。認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移可能與CD44S和CD44V的表達(dá)失衡有關(guān)。CD44S丟失提示細(xì)胞間黏附能力減弱，惡性瘤細(xì)胞易于浸潤。也有提出腫瘤細(xì)胞表達(dá)的過量CD44與間質(zhì)的透明質(zhì)酸相互作用促使其擴(kuò)散而侵入血管或淋巴管，CD44V6高表達(dá)的癌細(xì)胞可能獲得淋巴細(xì)胞樣的“偽裝”，逃避人體免疫系統(tǒng)的識別和殺傷，更容易進(jìn)入淋巴結(jié)，繼而導(dǎo)致轉(zhuǎn)移。

關(guān)于P-選擇素與CD44兩者相互作用的機(jī)制，本結(jié)果顯示，P-選擇素呈陽性表達(dá)的83例乳腺癌中有74例CD44V6呈陽性表達(dá)，兩者呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.414，P＜0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞系LS174T細(xì)胞表面的CD44V是一個類似P-選擇素配體PSGL-1的功能性配體，其結(jié)合的位點(diǎn)也類似于PSGL-1［6］。結(jié)合上述報道推測:(1)過度表達(dá)CD44V6的乳腺癌細(xì)胞，容易與ECM黏附并通過改變細(xì)胞骨架蛋白的構(gòu)型，參與細(xì)胞偽足的形成，促進(jìn)細(xì)胞侵入脈管壁;(2)P-選擇素的高表達(dá)，使侵入脈管的癌細(xì)胞很快與血小板結(jié)合形成瘤細(xì)胞栓子;(3)而P-選擇素與CD44V6兩者協(xié)同作用，使癌細(xì)胞獲得淋巴細(xì)胞樣的偽裝，瘤細(xì)胞栓子的形成與淋巴細(xì)胞樣偽裝的獲得，似一封閉的載體協(xié)助癌細(xì)胞逃避了機(jī)體的免疫殺傷作用，完成血液與淋巴液之間的循環(huán)，并歸巢于淋巴結(jié)，最終使得淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成為可能。

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