131I-組胺-吲哚美辛及其在荷Lewis肺癌小鼠體內分布、療效觀察的實驗研究

羅佳文 張彩霞 劉侃峰

1 (大連醫科大學附屬第二醫院 大連 116027)

2 (中國醫科大學附屬盛京醫院 沈陽 110004)

3 (浙江醫科大學附屬第一醫院PET-CT中心 杭州 310003)

吲哚美辛(Indomethacin, IN)是一種傳統的非甾體類抗炎藥，對結腸癌、胃癌、肺癌、喉癌、白血病等有顯著的治療效果，其可能的作用機制：抑制環氧合酶-2(cyclooxygenase,COX-2)表達、誘導細胞凋亡、抑制細胞增生及抗氧化作用等[1]。文獻[2]用氚標記IN進行親腫瘤實驗研究，結果表明，IN可選擇性地聚集于腫瘤組織，存留時間較其他組織明顯延長；鑒于131I有理想的核物理性能，我們選擇131I標記IN衍生物進行抗腫瘤研究。采用放射性核素標記化療藥物治療腫瘤，使核素的內照射作用與化學藥物的化療作用相結合，提高腫瘤療效是腫瘤核醫學的研究熱點[3]。

1 實驗方法

1.1 材料與儀器

IN純品(中國珠海海利來公司產品)、組胺二鹽酸鹽(美國Sigma產品)，其余有機試劑均為國產分析純。Na131I溶液(中國成都中核高通同位素股份有限公司)、GF254薄層硅膠板(江蘇漢邦科技有限公司)、放射性薄層掃描儀(美國 Bioscan公司)。荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠(中國醫學科學院附屬腫瘤醫院動物中心)、昆明裸鼠(中國醫科大學附屬盛京醫院動物中心提供)，SN-695 型自動γ計數儀(上海日環光電儀器有限公司)、光學顯微鏡(Olympus C-5050）、數碼相機(Olympus BX41)。

1.2 HIS-IN的合成

IN與二氯亞砜混合后，加熱回流1 h，減壓濃縮后加入丙酮，制得吲哚美辛酰氯的丙酮液備用。另取組胺二鹽酸鹽加入丙酮中，冰水浴下攪拌，加入無水碳酸鉀，于5oC下攪拌1 h，在≤10oC條件下，于 60 min內向該反應液中滴加吲哚美辛酰氯的丙酮液，升至室溫攪拌1 h，回流保持3 h后，將所得反應液濃縮蒸除丙酮后，加入氯仿反復萃取、干燥、重結晶得到成品，其合成路線見圖1。

1.3 131I標記HIS-IN

1.3.1 氯胺-T法標記

標記管中依次加入10 μL溶于無水乙醇的HISIN衍生物(2–4mg/mL)，6 μL Na131I(11–22 MBq)，10 μL氯胺-T(1–5 mg/mL，50 mmoL/L PBS，pH 7.3–7.6)，室溫振蕩反應 1–10 min，加入 100 μL Na2S2O3(5–10 mg/mL，50 mmoL/L PBS，pH 7.3–7.6)混勻終止反應。空白對照組 6 μL Na131I(11–22 MBq)，10 μL氯胺-T(1–5 mg/mL，50 mmoL/L PBS，pH 7.3–7.6)，室溫振蕩反應1–10 min，加入100 μL Na2S2O3(5–10 mg/mL，50 mmoL/L PBS，PH 7.3–7.6)混勻終止反應[4,5]。

圖1 組胺-吲哚美辛合成路線Fig.1 Synthesis of Histamine-Indomethacin.

1.3.2 標記物質控

采用薄層層析法測定產物標記率及放化純，支持物為 GF254硅膠薄層板，展開劑為三氯甲烷:甲醇＝8.5:1.5(V/V)，層析完成后經放射性薄層掃描儀檢測指標。采用乙酸乙酯萃取法對標記物進行純化，收集有機相通風櫥中吹干備用[6]。穩定性實驗：131IHIS-IN標記完成后，于常溫放置1、3、7天，測定其放射性化學純度，觀察標記物的穩定性。

1.4 131I-HIS-IN在荷瘤鼠及正常鼠體內分布實驗

1.4.1 荷Lewis肺癌小鼠模型的建立

將腫瘤直徑1 cm左右的荷Lewis肺癌C57BL/6模型鼠處死，取生長良好的腫瘤組織5 g用研磨器磨碎，加生理鹽水15 mL稀釋成細胞懸液。無菌條件下，每只昆明小鼠右腋窩皮下注射0.2 mL細胞懸液，待瘤體直徑達1 cm左右即用于實驗。

1.4.2 荷瘤小鼠體內分布實驗

荷Lewis肺癌小鼠35只，查隨機數字表對所有小鼠匹配隨機數字，按隨機數字分為7組，每組5只。注射標記物前3天，每天每鼠尾靜脈注射0.1%碘化鉀2 mL以封閉甲狀腺。實驗前所有小鼠禁食8 h以上，尾靜脈注射131I-HIS-IN 185 kBq/只(0.2 mL，含HIS-IN 90 μg)，分別于給藥后2、4、8、12、16、24、48 h摘眼球采集血樣，用斷頸法處死小鼠。取心、肝、脾、肺、腎、胃、甲狀腺、腫瘤組織，用生理鹽水洗凈表面浮血后濾紙吸干，稱重后于r井型計數儀測定各樣本放射性計數率，計算%ID·g–1和腫瘤組織與其他組織(T/NT)的放射性比值[7]。預留給藥后12、24、48 h組的腫瘤組織作病理觀察。

1.4.3 正常小鼠體內分布實驗

正常昆明小鼠35只，隨機分為7組，每組5只，按上述方法給藥、取材并測量(%ID·g–1)。

1.5 病理檢查和統計學分析

取上述三組腫瘤組織用10%中性甲醛緩沖液固定，石蠟切片，做HE染色，光鏡下觀察各治療組腫瘤細胞的壞死情況。

用SPSS13.0軟件進行單向方差分析，若組間有統計學意義則進行兩兩比較的 SNK-q檢驗，以P<0.05具有統計學意義。

2 結果

(1) 合成的HIS-IN為微黃色晶體。MS(m/e)：451(M+)，473(M+Na+)，449(M-H+)，485(M+CL-)。1H-NMR(μg·g–1)：δ11.7(17H)；8.07(12H)；7.60–7.70(2'，3'，5'，6')；7.47(16 H)；7.10(4 H，J=2.3 Hz)；6.90(7 H，J=8.9 Hz)；6.71(15 H)；6.68(6 H，J=8.9 Hz，J=2.4 Hz)；3.74(5-OCH3)；3.48(11 H)；3.20(13 H)；2.60(14 H)；2.20(10H)。

(2) HIS-IN用氯胺-T法最佳標記條件為：10 μL HIS-IN 無水乙醇溶解液(2 mg/mL)，加入 6 μL Na131I(11 MBq)，10 μL氯胺-T(1 mg/mL，50 mmoL/L PBS，pH 7.3)，室溫振蕩反應1 min，加入100 μL Na2S2O3(5 mg/mL，50 mmoL/L PBS，pH 7.3)混勻終止反應。實驗中發現，若加大氯胺-T濃度，標記率下降，延長振蕩反應時間不能提高標記率。按上述標記液配制比例，平均標記率可達65%。在以GF254硅膠為支持介質、以三氯甲烷:甲醇＝8.5:1.5(V/V)為展開劑的層析體系中，131I-HIS-IN Rf為0.6–0.7，而游離131I的Rf為0–0.1(見圖2，圖中縱坐標0點處橫線代表放射性波動基線，通過放射性薄層檢測儀分析軟件自動生成Rf及標記率等指標)。

圖2 標記物(a)和空白對照組(b)TLC放射性薄層掃描圖，峰I為標記物峰，峰II為原點峰Fig.2 TLC of 131I-HIS-IN. PeakⅠwas the marker, and PeakⅡwas the base point.

(3) 用乙酸乙酯與蒸餾水(V:V=2:2)4 mL混合液反復萃取3次，收集有機相，通風廚中吹干，終產物放化純可達98%以上。終產物結晶品常溫放置1、3、7天后，放化純分別為97.8%、96.5%和95.5%，結果顯示，131I-HIS-IN至少在一周內保持穩定，適用于生物學分布研究及進一步治療研究。

(4)131I-HIS-IN在荷Lewis肺癌小鼠體內分布實驗結果(表1)表明，2 h后131I-HIS-IN在血、心、腎及腫瘤組織中分布較多，腫瘤組織在給藥4 h時放射性分布達峰值(%ID·g–1=4.73±0.07)，非腫瘤組織中(除腎臟外)放射性分布量迅速減少，此時間點后131I-HIS-IN在腫瘤組織中的清除速率明顯慢于其他組織(圖3)。給藥2 h后腫瘤組織與血、心、肝、脾等臟器的比值(T/NT)逐漸增加且達高峰，腫瘤/血比值4、8、12、16、24、48 h時分別為2.23±0.14、2.95±0.30、3.07±0.73、3.54±0.54、3.07±0.31、6.43±0.58；除12 h組與16 h組比較無統計學意義外，其余各組間比較均具有統計學意義(圖4)。腎臟的放射性分布早期隨時間延長有逐步增加的趨勢，在4 h時放射性分布達高峰，表明該藥物主要經腎臟排泄。正常小鼠體內分布實驗結果與上述結果相似(表2)。

表1 131I-HIS-IN在荷Lewis鼠體內生物學分布(±SD, %ID·g–1, n=5)Table 1 Biodistribution of 131I-HIS-IN in mice with Lewis pulmonary tumor.

表1 131I-HIS-IN在荷Lewis鼠體內生物學分布(±SD, %ID·g–1, n=5)Table 1 Biodistribution of 131I-HIS-IN in mice with Lewis pulmonary tumor.

器官Organs 2 h 4 h 8 h 12 h 16 h 24 h 48 h血Blood 4.75±0.36 2.13±0.14 1.26±0.18 0.72±0.12 0.58±0.07 0.43±0.04 0.20±0.02心Heart 3.69±0.34 1.09±0.22 0.73±0.18 0.49±0.05 0.38±0.06 0.34±0.08 0.11±0.02肝臟Liver 3.13±0.55 1.45±0.18 0.94±0.12 0.60±0.15 0.43±0.03 0.34±0.03 0.15±0.04脾臟Spleen 1.88±0.55 0.64±0.11 0.63±0.07 0.41±0.05 0.37±0.06 0.24±0.04 0.09±0.04肺臟Lung 2.77±0.26 1.31±0.21 0.74±0.11 0.49±0.03 0.43±0.05 0.30±0.05 0.13±0.03腎臟Kidney 9.99±0.69 10.11±0.82 6.0±0.69 2.80±0.88 1.22±0.15 0.61±0.12 0.38±0.04胃Stomach 2.12±0.14 1.18±0.28 0.88±0.07 0.49±0.07 0.38±0.03 0.28±0.06 0.14±0.01甲狀腺Thyroid 2.76±0.09 1.62±0.24 1.39±0.07 1.36±0.25 1.06±0.07 0.88±0.07 0.75±0.09腫瘤Tumor 4.13±0.16 4.73±0.07 3.71±0.56 2.14±0.13 2.02±0.09 1.31±0.06 1.25±0.07

圖3 131I-HIS-IN在荷Lewis鼠血、心臟、腫瘤中分布趨勢Fig.3 The trendgraphy of 131I-HIS-IN in blood, heart and tumor of mice with lewis pulmonary tumor.

圖4 不同時間點部分組織T/NT走勢圖Fig.4 Tumor/blood and tumor/heart as a function of the post-injection hours.

表2 131I-HIS-IN在正常鼠體內生物學分布(±SD, %ID·g–1, n=5)Table 2 Biodistribution of 131I-HIS-IN in normal mice.

表2 131I-HIS-IN在正常鼠體內生物學分布(±SD, %ID·g–1, n=5)Table 2 Biodistribution of 131I-HIS-IN in normal mice.

器官Organs 2 h 4 h 8 h 12 h 16 h 24 h 48 h血Blood 5.71±0.24 2.72±0.42 1.54±0.21 1.07±0.18 0.97±0.03 0.62±0.01 0.35±0.02心臟Heart 3.89±0.17 1.98±0.08 0.98±0.05 0.75±0.08 0.53±0.04 0.52±0.12 0.19±0.01肝臟Liver 3.42±0.31 1.84±0.08 1.90±0.14 0.57±0.19 0.71±0.05 0.54±0.01 0.21±0.03脾臟Spleen 2.25±0.97 0.85±0.02 0.80±0.04 0.60±0.10 0.42±0.07 0.50±0.06 0.13±0.02肺臟Lung 2.97±0.19 1.51±0.06 0.89±0.01 0.65±0.06 0.48±0.02 0.44±0.02 0.19±0.40腎臟Kidney 12.96±1.13 14.01±1.43 10.03±0.96 4.21±0.79 2.01±0.09 0.73±0.06 0.34±0.01胃 Stomach 2.24±0.14 1.27±0.21 1.02±0.04 0.84±0.19 0.69±0.06 0.39±0.03 0.18±0.01甲狀腺Thyroid 2.86±0.02 2.13±0.40 2.10±0.18 2.17±0.12 1.62±0.22 0.87±0.07 0.62±0.03

(5) 肉眼及光鏡下觀察不同時間段的腫瘤組織，中心均有不同程度的壞死，且壞死部分隨時間推移而增多，同時出現一定量的碎裂細胞，細胞碎裂數目逐漸增加。

3 討論

Wagner[3]指出，用放射性核素標記化療藥物使內照射與化療作用相結合，將是腫瘤治療學的主要研究熱點。IN作為傳統的非甾體類抗炎藥，對腫瘤細胞有確切的化學毒性作用，還具有明確的放療增敏作用。陳春梅等[8]用微觀放射性自顯影技術觀察IN在Lewis肺癌內的亞細胞定位，發現IN在細胞胞漿、胞核及胞膜上均有較多分布。實驗結果提示，用131I及90Y等腫瘤治療核素標記IN有如下優勢：(1) IN作為載體將核素聚集于腫瘤細胞內或其表面，核素放出的射線(β粒子)具有電離輻射生物效應，其作用于腫瘤組織以殺傷或殺死腫瘤細胞；(2) IN發揮抑制腫瘤化學毒性及增強核素的電離輻射作用，在腫瘤局部發揮雙重治療功效。

IN抗腫瘤作用主要通過抑制COX-2途徑實現，Khann等[9]發現，改變IN的羧酸結構會增強IN抑制COX-2活性的能力。IN缺乏易被131I標記的基團，而組胺、酪胺等物質則含有易于被131I標記的組胺環、酪胺環，本實驗設計IN 3位的乙酸與組胺側鏈的伯胺由酰胺鍵形成穩定的衍生物(HIS-IN)，該衍生物不會降低IN抑制COX-2活性，故不會改變 IN抗腫瘤作用，同時又增加了可供放射性碘標記的組胺環。實驗結果表明，131I-HIS-IN標記方法簡單易行、標記產率高、體外穩定性高。

131I-HIS-IN在荷Lewis肺癌小鼠體內分布結果顯示：給藥2 h后腫瘤、心、腎等組織放射性分布均較高。腫瘤組織在4h時%ID·g–1達峰值，隨時間延長藥物在腫瘤組織的清除速度明顯慢于其他組織。腫瘤/血液、腫瘤/心臟等比值隨給藥時間延長逐漸升高，且從給藥后4 h起組間差異大部分具有統計學意義，48 h時非腫瘤組織的%ID·g–1均值小于1，而腫瘤組織的%ID·g–1均值為1.25，與其他組織比較具有統計學意義，表明131I-HIS-IN在腫瘤組織中的有效作用時間至少在給藥后48 h內。雙腎放射性分布較高，在4 h時腎臟的放射性分布達高峰，隨時間延長，其放射性逐漸減低，提示該藥物主要經腎臟排泄。

不同時間段的腫瘤組織均有不同程度的壞死，壞死部分隨時間推移而增多，表明131I-HIS-IN對腫瘤細胞有明顯的毒性作用，且隨時間延長，對腫瘤細胞的殺傷作用逐漸增強。

綜上所述，本實驗合成的131I-HIS-IN保留了IN瘤組織親和性，可顯著聚集于腫瘤組織中，且存留時間較長，對腫瘤細胞有明顯的毒性作用，作用效果隨時間延長有增加趨勢。實驗結果表明，131I-HISIN適用于抗腫瘤的研究，可成為新一類抗腫瘤放射性藥物。

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