DC－CIK 細胞治療小兒惡性腫瘤研究現狀

王亞峰 綜述 劉秋玲 審校

小兒惡性腫瘤無論在臨床表現、組織病理類型還是治療反應上均與成人惡性腫瘤不同，有其獨特的生物學特性，如小兒癌腫潛伏期短，生長迅速，侵襲性強，多與環境的致癌因素無關，組織學上以母細胞瘤多見等［1］。近年來，隨著分子生物學研究的不斷深入及綜合治療方法的不斷完善，腫瘤的診治水平得到了很大提高［2］。目前，除了手術、化療及放療外，細胞免疫治療已成為小兒腫瘤治療的第4 種重要手段。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是功能強大的專職抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)，可高效介導對特異性抗原的特異性免疫應答。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine－induced killer cells，CIK)是一種新型高效的免疫效應細胞，具有增殖速度快、殺傷活性高等優點。樹突狀細胞聯合細胞因子誘導的殺傷細胞(DC－CIK)共同培養后，具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性和自然殺傷細胞的非組織相容性復合物限制性殺傷特性［3］，擁有強大的增殖活性和細胞毒活性。作為新一代過繼免疫細胞，DC－CIK 細胞目前已被用于多種成人腫瘤的治療，在部分小兒惡性腫瘤的治療中，DC－CIK 細胞也顯示出其獨特的療效。筆者就DC－CIK 細胞在小兒惡性腫瘤治療中的應用情況作一綜述。

1 DC 細胞的生物學特性與抗腫瘤機制

1.1 DC 的生物學特性 1973 年Steinman 和Cohn 首次發現DC，因其表面的指狀突起而稱其為樹突狀細胞。DC 已被證明是目前發現的功能最強大的抗原提呈細胞，其抗原遞呈能力較B 淋巴細胞和巨噬細胞強數百倍甚至上千倍［4］。DC可通過下列4 種方式調控、維持機體免疫反應:(1)激活靜息型T 細胞誘導抗原特異性細胞毒性T 淋巴細胞的產生，是機體免疫反應的啟動者和參與者;(2)直接或間接影響B 淋巴細胞的增殖、活化，參與體液免疫應答;(3)與記憶T 細胞相互作用，誘發再次免疫應答;(4)與自然殺傷細胞作用，促進機體建立非特異性、天然免疫應答等［5，6］。DC 廣泛分布于除腦以外的全身各臟器，能攝取加工抗原表達高水平MHC 分子、共刺激分子、黏附分子，并分泌高水平Th1 型細胞因子IL－12，故具有很強的抗原提呈能力，可有效激發T 細胞應答。人DC 的主要特征性標志為CDla、CD83 及CD11c。DC還表達MHCⅡ類分子，輔助刺激分子CD80 及CD86，黏附分子CD40、CD44、CD54 以及β1、β2 整合素家族成員。此外，DC 還能分泌IL－1、IL－6、IL－8、IL－12、TNF－α、IFN－α等細胞因子，參與機體的免疫調節。

1.2 DC 的抗腫瘤機制 大量研究發現，DC 的抗腫瘤機制主要有［7］:(1)誘導產生大量效應T 細胞。在腫瘤患者體內，只有抗原提呈細胞捕獲并加工處理呈遞腫瘤抗原后，才能形成針對腫瘤抗原的特異性T 細胞克隆，從而形成有效的抗腫瘤免疫效應。針對腫瘤患者體內的免疫狀況，DC 可在抗腫瘤治療中表現出其突出的優勢，如通過細胞表面高水平的MHC－I、MHC－Ⅱ類分子呈遞豐富的腫瘤抗原肽作為激活抗腫瘤細胞毒性T 淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的第一信號，同時提供高水平的B7－1、B7－2、CD40 等黏附分子作為第二信號而充分激活腫瘤特異性的CTL。(2)啟動效應T 細胞遷移至腫瘤部位。DC 有別于其他抗原提呈細胞的突出特性之一是其具有較強的定向遷徙能力。有報道表明，DC 能通過分泌細胞因子和趨化因子選擇性趨化T 細胞，通過血管內皮屏障而增加腫瘤部位的效應T 細胞數量。(3)保持效應T 細胞在腫瘤部位的長期存在。DC 和T 細胞之間的相互作用，以及濾泡DC 對抗原的保留都可促使DC分泌某些生存因子而促進T 細胞的生長，維持T 細胞反應。(4)抑制腫瘤血管的生成。DC 可能通過釋放某些抗血管生成物質IFN－γ、IL－12 及前血管生成因子而影響腫瘤血管的形成。(5)DC 與T 細胞結合后，可以分泌大量IL－12 及IL－ 8 等細胞因子，主導CD4+Thl 型的免疫應答，有利于對腫瘤病灶的清除。

2 CIK 細胞的生物學活性與抗腫瘤機制

2.1 CIK 細胞的生物活性 CIK 細胞最初是指在健康人體外周血中的CD3+CD56+T 淋巴細胞，占1% ～5%。Schmidt－wolf 等［8］于1991 年首次發現在外周血淋巴細胞中加入IFN－γ、IL－2 和抗CD3 單克隆抗體，可培養出大量CD3+和CD56+T 細胞，兼具有T 淋巴細胞的抗腫瘤活性和NK 細胞的非MHC 限制性殺瘤活性，具有增殖速度快，殺傷活性高，抗瘤譜廣等特性。通過對CIK 細胞的表面標志研究發現，CIK 細胞為CD3+CD56+細胞群，而這些CD3+CD56+CIK 細胞主要來源于CD3+CD56+的T 淋巴細胞，而非CD3+CD56+的NK 細胞。CIK 細胞的另一重要來源是CD4+CD8+T 淋巴細胞群。由于CD4+CD8+T 細胞經過1 個月的細胞因子誘導培養后，有56%的T 細胞可同時表達CD3+CD56+，說明CD4+CD8+T 細胞也是CIK 細胞的重要來源。這種雙陽性T 細胞按細胞受體的不同，進一步可分為CD3+CD56+αβT 細胞及CD3+CD56+γδT 細胞兩種亞群［9，10］。

2.2 CIK 細胞的抗腫瘤機制 目前關于CIK 細胞對腫瘤細胞的殺傷原理尚未完全闡明，研究表明，其可能的機制有以下幾點:(1)CIK 細胞能通過黏附因子識別腫瘤細胞，通過兩條途徑直接殺傷靶細胞:一是CIK 細胞通過淋巴細胞功能相關抗原－1/細胞間黏附分子－1(LFA－1/ICAM－1)系統與靶細胞通過釋放顆粒酶和穿孔素對靶細胞實行MHC 非限制性殺傷。另一途徑為CIK 細胞表面的CD3 樣受體被結合而激活CIK 細胞產生胞漿毒性顆粒介導的溶細胞作用［11］。(2)CIK 細胞活化后可分泌IL－2、TNF－α、IFN－γ、GM－CSF 等多種抗腫瘤細胞因子，提高了細胞毒作用，或調節腫瘤細胞對CIK 細胞的敏感性，發揮直接抑制作用和免疫系統介導的間接殺傷作用［12］。(3)誘導腫瘤細胞凋亡及壞死。CIK 細胞能活化腫瘤細胞凋亡基因，使得FLIP、Bcl－2、Bcl－xL、DAD1 和survivin 基因表達上調［13］。Cooper 等［14］的研究顯示，培養的CIK 細胞表面表達的Fas－L (fas 配體)與相應腫瘤細胞識別結合后，可激活細胞內源性DNA 內切酶，從而起到殺瘤作用。(4)CIK 細胞回輸后可以激活機體免疫系統，提高機體的免疫功能。

3 CIK 與DC 的協同抗腫瘤作用

臨床研究發現部分患者進行CIK 細胞治療時療效不太理想，原因可能是腫瘤細胞對這些免疫效應細胞發生了抵抗，可能與腫瘤患者功能性的DC 缺乏有關［15］。因此，將CIK 細胞與DC 聯合治療惡性腫瘤，將有助于解除部分腫瘤患者T 細胞的免疫無能，從而發揮協同抗腫瘤作用。研究表明，DC 和CIK 共同培養后具有更強的腫瘤殺傷活性，體外擴增速度更快，殺瘤譜更廣［16］。DC 和CIK 是腫瘤免疫治療的兩個重要部分，前者識別抗原、激活獲得性免疫系統，后者通過發揮自身細胞毒性和分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞，二者聯合確保了一個高效和諧的免疫體系［17］。目前，關于DC－CIK 殺傷腫瘤細胞的機制尚不十分清楚，除上述的CIK 細胞抗腫瘤機制外，劉苗等［18，19］實驗證實還可能與Foxp3 和GATA－3 基因參與了T－bet 介導的DC－CIK 細胞殺瘤途徑有關，其殺瘤機制主要表現為Th1 途徑活化，而Th2 途徑和Treg 途徑受抑制。

4 DC－CIK 細胞在小兒惡性腫瘤中的應用現狀

4.1 DC－CIK 細胞在兒童白血病治療中的應用 目前，已有少數學者運用DC－CIK 細胞治療小兒白血病。文欽等［20］對1 例難治復發性髓細胞白血病患兒行DC－CIK 細胞治療，DC－CIK 細胞共輸注5 次，患兒均未出現不良反應。定期復查血常規、肝腎功能、巨細胞病毒指標，均在正常范圍內，細胞治療107 d 后復查骨髓示完全緩解。Liu 等［21］從白血病患兒骨髓中獲得單個核細胞，并在體外培養成DC－CIK 細胞。在培養10 ～25 d 后，將DC－CIK 與白血病細胞混合培養并用MTT 法檢測其殺瘤活性。結果顯示:在效靶比為12.5∶1或25∶1 時，殺瘤率可達50% ～60%，提示DC－CIK 細胞對兒童白血病細胞具有強大的殺傷作用。這些研究結果將推進臨床DC－CIK 細胞治療兒童白血病的發展，尤其是對難治復發性白血病提供新的治療方法。

4.2 DC－CIK 細胞在兒童惡性淋巴瘤治療中的應用 惡性淋巴瘤在成人中多見，兒童惡性淋巴瘤的發病率較成人低，以非霍奇金淋巴瘤為主，預后較差。在成人惡性淋巴瘤臨床治療應用中DC－CIK 細胞療法已取得顯著效果［22－24］，在兒童淋巴瘤的臨床治療中尚未見資料報道，但已有學者進行了相關的的實驗室研究。Wei 等［25］從健康志愿者外周血中培養出DC－CIK 細胞，將其培養9 d 后與Raji 淋巴瘤細胞混合培養，在一定效靶比下觀察DC－CIK 細胞對淋巴瘤細胞的殺傷率。結果顯示:在效靶比為40 ∶1 時殺傷率最高，達(67.18 ±4.01)%，而且殺傷率與效靶比在5∶1 至40∶1 之間呈正相關。袁利亞等［26］取昆明小鼠骨髓單個核細胞在體外誘導DC－CIK 細胞，再將小鼠EL4 淋巴瘤Pcc4 胚癌細胞株作為靶細胞，培養一段時間后與DC－CIK 細胞混合培養，用流式細胞術檢測免疫表型，MTT 法測定殺傷活性。結果顯示:DC－CIK 細胞共培養后，CD3+和CD3+CD8+雙陽性細胞顯著增多，在(5∶1)～(40∶1)的效靶比范圍內，DC－CIK細胞對淋巴瘤細胞有較強的殺傷率。

4.3 DC－CIK 細胞在兒童惡性肉瘤治療中的應用 兒童惡性肉瘤(如橫紋肌肉瘤、尤文肉瘤等)發病率較低，臨床治療主要以化療、手術加局部放療為主。細胞免疫療法可能會具有顯著的治療效果，但目前尚處在實驗研究階段。Kucis等［27］從6 名健康志愿者外周血中提取單個核細胞，然后培養成CIK 細胞，再將CIK 細胞分別和橫紋肌肉瘤細胞株RMS13、Rh30、RH41 等在一定條件下混合培養。對CIK 表型分子、增殖速度、殺瘤率等多個指標進行觀察后發現:CIK 細胞與橫紋肌肉瘤細胞株混合培養后，約有50%的橫紋肌肉瘤細胞被殺死，其中NKG2D 可能在殺瘤過程中起了重要作用。Michael 等［28］對尤文肉瘤細胞株進行熒光染色，傳代培養后建立裸鼠模型。將含有CD3xHer2/neu 雙抗體的CIK 細胞注射裸鼠并觀察腫瘤生長變化。結果顯示:含有CD3xHer2/neu 雙抗體的CIK 細胞有強大的細胞毒作用，對腫瘤細胞有明顯的抑制作用。上述研究的CIK 細胞缺少DC 的激活，殺瘤活性有待進一步增強。

4.4 DC－CIK 細胞在兒童視網膜母細胞瘤治療中的應用視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是兒童常見的眼內惡性腫瘤，目前主要以手術、化療、放療及局部治療進行綜合治療，細胞免疫治療因其獨特的優越性有可能成為治療RB 新的重要手段。唐松等［29］從RB 外周血中誘導擴增出成熟DC，并進一步利用RB 腫瘤抗原沖擊致敏DC，激活自體T 淋巴細胞，通過不同的效靶比體外對視網膜母細胞瘤細胞株SO－RB50 進行殺傷。結果表明，DC 誘導的細胞毒性T 淋巴細胞對SO－ RB50 有較強的殺傷作用，顯示出細胞免疫療法在治療RB 上有潛在的臨床價值，但目前國內外尚無文獻報道DC－CIK 細胞治療RB 的資料。

4.5 DC－CIK 細胞在兒童神經母細胞瘤治療中的應用 兒童神經母細胞瘤是兒童最常見的顱外神經源性實體瘤，惡性程度高，進展較快，易發生早期轉移［30］，傳統治療方法療效不理想。有研究表明:細胞因子誘導的自然殺傷細胞對神經母細胞瘤有一定的殺傷作用。Richard 等［31］把神經母細胞瘤細胞注入28 只小鼠體內，待腫瘤生長一段時間后，再向小鼠體內注射IL－2 和IL－18 誘導的自然殺傷細胞。結果顯示:實驗組中有57%小鼠的瘤細胞完全消失。關于DC－CIK 細胞治療神經母細胞瘤在國內外尚未見文獻報道。

5 問題與展望

目前，DC－CIK 細胞在成人腫瘤的臨床治療已經開展，但開展時間較短，數據也不豐富，需繼續擴大DC－CIK 細胞治療的臨床應用范圍，以獲取更多的臨床資料。小兒惡性腫瘤在腫瘤的發生和生物學特性方面與成人腫瘤有很大區別，且小兒的免疫系統尚未發育完全，免疫功能低下，耐受性差，所以DC－CIK 細胞免疫療法除在小兒血液系統惡性腫瘤中有少數臨床應用外，在其他小兒惡性腫瘤中均停留在實驗研究階段，國內外尚無臨床試驗的資料報道。另外，DC－CIK的治療方案和療效標準尚待進一步統一和規范。細胞治療注射途徑、不良反應和注射時間等需要進一步探討，尤其是不良反應，雖然不似化療藥物那樣具有明顯的細胞毒作用，但其培養體系中不少成分也能引起一定不良反應，如IL－2、IFN－γ 可引起寒戰、發熱、肌痛及胃腸道反應等，需引起臨床足夠的重視。隨著相關研究的不斷深入，DC－CIK 過繼免疫細胞療法在聯合放療、化療及手術治療中的價值以及在腫瘤綜合治療中的地位將會得到進一步證實和肯定，從而進一步提高臨床療效，最大程度地改善腫瘤患者的生活質量。

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