DLC-1、FAK及p130Crk相關(guān)底物在卵巢上皮性癌中的表達及意義

任 芳，史惠蓉，陳志敏，樊冬梅，劉慧娜，紀 妹，韓麗萍

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 河南鄭州 450052)

卵巢癌是女性生殖器官3大惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤之首，5年生存率僅25%～30%，已成為威脅婦女生命和健康的主要原因。卵巢癌由于缺乏早期診斷方法，發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已屬晚期，且有約60%～70%患者在治療中發(fā)生耐藥和復發(fā)轉(zhuǎn)移。因此，尋找能早期診斷及判斷預后的相關(guān)因子，以及有效治療靶點是目前卵巢癌研究的重點。肝癌缺失因子-1(deleted in liver cancer-1，DLC-1)［1，2］是一種腫瘤抑制基因，與細胞凋亡、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一類非受體型胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶，分布在細胞粘著斑部位［3］。信號分子p130Crk相關(guān)底物(Crk-associated substrate 130 kDa，p130Cas)是一種高度磷酸化的蛋白質(zhì)，在細胞的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用［4，5］。本研究應用免疫組化技術(shù)檢測DLC-1、FAK和p130Cas在正常卵巢組織及卵巢上皮性癌中的表達，分析3者在卵巢上皮性癌中表達之間的相關(guān)性及其與卵巢癌臨床病理指標之間的關(guān)系，探討DLC-1、FAK和p130Cas的檢測對于卵巢上皮性癌早期診斷和預后分析存在的潛在價值。

1 臨床資料與方法

1.1 臨床資料 收集2006年至2008年鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦科手術(shù)存檔蠟塊，其中正常卵巢組織(因子宮肌瘤而行卵巢切除者)22例，卵巢上皮性癌62例。62例卵巢癌患者的年齡19～73歲，中位年齡50歲。所有標本均為初次診斷，術(shù)后經(jīng)病理學診斷證實，患者術(shù)前均未經(jīng)過放療和化療。

1.2 主要試劑 山羊抗人DLC-1多克隆抗體(ab21200，稀釋濃度為1∶100)購自英國Abcam公司;鼠抗人FAK單克隆抗體(SC-1688，稀釋濃度為1∶50)為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品;p130Cas鼠抗人單克隆抗體購自美國Neomarkers公司;免疫組化SP、PV試劑盒及DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.3 免疫組織化學方法 常規(guī)4 μm厚度連續(xù)切片、貼片、脫蠟。免疫組織化學染色按照試劑盒的操作步驟進行。所有切片染色均在相同條件下進行，每批染色均設陽性對照和陰性對照。結(jié)果判定:以胞漿內(nèi)有黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞。染色強度:無著色(0分);染色淡黃(1分);染色黃(2分);染色棕黃(3分)。陽性細胞數(shù):陽性細胞數(shù)量的百分比≤5%(0分);5%＜陽性細胞數(shù)量的百分比≤25%(1分);25%＜陽性細胞數(shù)量的百分比≤50%(2分);陽性細胞數(shù)量的百分比＞50%(3分)。最終評分=染色強度×陽性細胞數(shù)。根據(jù)分值可將染色結(jié)果分為:陰性:0-1分;陽性:＞2分。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料采用 χ2檢驗;相關(guān)性檢驗采用Spearmen等級相關(guān)分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌和正常卵巢組織中的表達情況 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌中的陽性表達率分別為54.8%、79.0%和87.1%;在正常卵巢組織中的陽性表達率分別為100%、27.3%和31.8%。DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌中的表達與正常卵巢組織相比，其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 DLC-1和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌組織和正常卵巢組織中的表達

2.2 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌組織中的表達與臨床病理特征間的關(guān)系 DLC-1蛋白的表達與卵巢癌的FIGO分期、有無腹水和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，與組織學類型、分化程度和年齡無關(guān)(P＞0.05)。FAK蛋白的表達與卵巢癌的分化程度、有無腹水和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)。p130Cas蛋白的表達與卵巢癌的FIGO分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。見表2。

2.3 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌組織中表達的相關(guān)性 DLC-1與FAK蛋白表達呈負相關(guān)(r=－3.08，P=0.015)。DLC-1和p130Cas蛋白表達之間呈負相關(guān)(r=－0.330，P=0.006)。

表2 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白的表達與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

3.1 DLC-1在卵巢上皮性癌中的表達及其意義 肝癌缺失基因(DLC-1)是1998年采用再現(xiàn)差異分析法發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，在人類多種腫瘤中呈低表達或表達缺失。DLC-1蛋白是RhoA和Cdc42特異性的GTP酶激動蛋白，參與基因轉(zhuǎn)錄、細胞周期調(diào)控及信號傳導通路的調(diào)節(jié)，與細胞凋亡、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移及細胞骨架形成關(guān)系密切［6，7］。

Kim等［2］對肝癌細胞株的研究發(fā)現(xiàn)DLC-1的過表達可以抑制腫瘤細胞的移行。Peng等［8］研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌中DLC-1的表達與腫瘤局部浸潤的范圍有關(guān)。而卵巢癌組織中的DLC-1表達情況報道很少。本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中DLC-1蛋白表達明顯低于正常卵巢組織(P＜0.05)，表明DLC-1的低表達與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)。在臨床期別晚、有腹水、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者中，DLC-1表達顯著降低(P＜0.05)，表明DLC-1與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移等生物學行為有直接關(guān)系。國外研究［9，10］發(fā)現(xiàn)肝癌和乳腺癌細胞系中DLC-1的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用，也從另一角度支持本研究的發(fā)現(xiàn)。

3.2 FAK在卵巢上皮性癌中的表達及其意義 粘著斑激酶(FAK)是一個多功能的非受體酪氨酸激酶，它在細胞間及細胞與細胞外基質(zhì)粘附中起關(guān)鍵作用，在許多腫瘤組織中都有FAK表達增加。FAK激活后，介導整合素、FAK/Src等多條信號傳導途徑來參與細胞的分化、增生以及腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等過程［11，12］。

Fujii等［13］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK在肝癌組織中呈過度表達;另外，Aalbers等［14］發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中FAK的高表達與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。本研究顯示，卵巢癌中FAK蛋白的表達顯著高于正常卵巢組織(P＜0.05)。在腫瘤分化程度低、有腹水、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者中，F(xiàn)AK表達顯著增高(P＜0.05)。表明高表達的FAK可能促進卵巢癌細胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)化，且與卵巢癌的浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。

3.3 p130Cas在卵巢上皮性癌中的表達及其意義

p130Cas最初在癌基因V-src和V-crk轉(zhuǎn)化的細胞中鑒定出來的一個高度磷酸化的蛋白質(zhì)［4，5］。作為整合素通路中關(guān)鍵的信號分子，p130Cas不僅參與細胞黏附、遷移、存活和增生等一系列的生理過程，還在細胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用。

Wei等［4］發(fā)現(xiàn)p130Cas與肺癌細胞的抗失巢生長密切相關(guān)。Wendt等［5］發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，p130Cas表達的降低能逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞侵襲和早期的遠處播散。本研究發(fā)現(xiàn)在卵巢上皮性癌組織中p130Cas的蛋白表達明顯高于正常卵巢組織。在臨床期別晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者中，p130Cas表達顯著增高(P＜0.05)。提示p130Cas在卵巢上皮性癌組織中的高表達可能與卵巢癌的浸潤轉(zhuǎn)移和病程進展有關(guān)。

3.4 DLC-1和FAK及p130Cas在卵巢上皮性癌組織中表達的相關(guān)性 DLC-1定位于局部黏著斑，因此要發(fā)揮其腫瘤抑制活性，對局部黏著斑的定位是必需的［15］。Kim等［2］在肝細胞癌中研究發(fā)現(xiàn):DLC-1可導致局部黏著斑蛋白如黏著斑激酶(FAK)、信號分子p130Crk相關(guān)底物(p130Cas)以及樁蛋白(paxillin)的去磷酸化，從而抑制癌細胞的遷移。p130Cas是局部黏著斑形成和細胞遷徙所必要的局部黏著斑復合體相關(guān)蛋白。DLC-1使p130Cas酪氨酸去磷酸化，導致肝癌細胞遷徙能力下降。同時，DLC-1表達引起FAK的去磷酸化失活，抑制了粘著斑的形成，使腫瘤細胞粘附性降低，從而誘導凋亡。以上均說明DLC-1抑制腫瘤細胞侵襲的作用可能是通過對FAK和p130Cas去磷酸化實現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)在卵巢上皮性癌中，DLC-1和FAK及p130Cas中的蛋白表達呈負相關(guān)。初步說明3者在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。推測低表達的DLC-1通過使FAK及p130Cas去磷酸化，從而在卵巢上皮性癌的發(fā)生尤其是浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。3者在卵巢癌中的表達均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示在卵巢上皮性癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移中，3者可能發(fā)揮某種重要的協(xié)同作用，尚有待于進一步的研究。本研究初步確定了DLC-1和FAK及p130Cas在卵巢上皮性癌中的表達以及與各臨床病理特征之間的關(guān)系，在一定程度上揭示卵巢上皮性癌發(fā)生發(fā)展中可能存在的分子生物學機制，3者蛋白表達之間負調(diào)控的關(guān)系為抑制卵巢惡性腫瘤發(fā)展提供一個很好的理論基礎(chǔ)，為更好的尋求新的治療靶點提供廣闊的思路，在卵巢上皮性癌的臨床治療尤其是對腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的干預方面可能有潛在的臨床價值。

［1］ Liao Y C，Lo S H.Deleted in liver cancer-1(DLC-1):a tumor suppressor not just for liver［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40(5): 843-847.

［2］ Kim T Y，Lee J W，Kim H P，et al.DLC-1，a GTPase-activating protein for Rho，is associated with cell proliferation，morphology，and migration in human hepatocellular carcinoma［J］.BiochemBiophys Res Commun，2007，355(1):72-77.

［3］ Golubovskaya V M，Kweh F A，Cance W G.Focal adhesion kinase and cancer［J］.HistolHistopathol，2009，24(4):503-510.

［4］ Wei L，Yang Y，Zhang X，et al.Anchorage-independent phosphorylation of p130(Cas)protects lung adenocarcinoma cells from anoikis［J］.J Cell Biochem，2002，87(4):439-449.

［5］ Wendt M K，Smith J A，Schiemann W P.p130Cas is required for mammary tumor growth and transforming growth factor-beta-mediated metastasis through regulation of Smad2/3 acti-vity［J］J BiolChem，2009，284(49):34145-34156.

［6］ Zhou X，Zimonjic D B，ParkS W，et al.DLC-1 suppresses distant dissemination of human hepatocellular carcinoma cells in nude mice through reduction of RhoAGTPase activity，actin cytoskeletal disruption and down-regulation of genes involved in metastasis［J］.Int J Oncol，2008，32(6):1285-1291.

［7］ Wong C C，Wong C M，KoF C，et al.Deleted in liver cancer 1(DLC-1)negatively regulates Rho/ROCK/MLC pathway in hepatocellular carcinoma［J］.Plos One，2008，3(7):2779.

［8］ Peng H，Zhao T，Yao K.Study of DLC-1 gene expression in nasopharyngeal carcinoma［J］.ZhonghuaEr Bi Yan HouKeZa Zhi，2002，37 (6):454-457.

［9］ Wong C M，Yam J W，Ching Y P，et al.RhoGTPase-activating protein deleted in liver cancer suppresses cell proliferation and invasion in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2005，65:8861-8868.

［10］Goodison S，Yuan J，Sloan D，et al.The RhoGAP protein DLC-1 functions as a metastasis suppressor in breast cancer cells［J］.Cancer Res，2005，65:6042–6053.

［11］ Zhao J，Guan J L.Signal transduction by focal adhesion kinase in cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2009，28(1-2):35-49.

［12］Chatzizacharias N A，Kouraklis G P，Theocharis S E.Clinical significance of FAK expression in human neoplasia［J］.Histol Histopathol，2008，23(5):629-50.

［13］Fujii T，Koshikawa K，Nomoto S，et al.Focal adhesion kinase is overexpressed in hepatocellular carcinoma and can be served as an independent prognostic factor［J］.J Hepatol，2004，41(1):104-111.

［14］de Heer P，Koudijs M M，van de Velde C J，et al.Combined expression of the non-receptor protein tyrosine kinases FAK and Src in primary colorectal cancer is associated with tumor recurrence and metastasis formation［J］.Eur J SurgOncol，2008，34(11):1253-1261.

［15］Liao Y C，ShihY P，LoS H，et al.Mutations in the focal adhesion targeting region of deleted in liver cancer-1 attenuate their expression and function［J］.Cancer Res，2008，68(19):7718-7722.