FQ-PCR檢測小鼠肝癌模型中Cyclin E mRNA方法的建立

劉素娜，張 艷，張晶敏，韓 立，江金花，周玉冰，王慶端

(1.鄭州大學基礎醫學院 河南鄭州 450001;2.鄭州大學醫藥科學研究院藥化室 河南鄭州 450052; 3.鄭州大學藥學院 河南鄭州 450001)

細胞周期蛋白(cyclins)是參與細胞周期調控的主要因子［1，2］。Cyclin E蛋白是cyclins中調控細胞周期的重要蛋白質，其過表達可促進細胞周期由G1期向S期過渡，導致細胞增殖失控，促進細胞惡性轉化和腫瘤發生。有研究證實，抑制cyclin E的表達可控制細胞惡性增殖、轉化和腫瘤發展［3，4］。Cyclin E通過促進食管癌細胞增殖對食管癌發生發展起重要作用［5］，其蛋白的表達可作為判斷腎透明細胞癌預后分子指標［6］。本實驗采用以管家基因β-actin作為內參基因，繪制目的基因和內參基因的標準曲線，建立用SYBR Green I熒光定量PCR技術檢測cyclin E表達方法，為腫瘤的發生發展機制研究及cyclin E靶點基因腫瘤治療建立良好的相對定量測定 cyclin E mRNA表達的實驗模型。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞株 H22肝癌細胞株購自南京凱基生物技術有限公司。SPF KM小鼠15只，18～22 g，6～8周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK(湘)2009-0004。小鼠在溫度20℃，濕度55%的IVC獨立供風系統內進行常規飼養。

1.2 建立H22肝癌動物模型 收集傳代第7～8天的H22肝癌細胞，用PBS洗兩次，0.4%的臺盼藍染色進行細胞計數，將細胞濃度調至1.2×107/ml接種于KM小鼠右腋下，每只動物接種0.2 ml，18 d后剖瘤稱重，將介于1.5～2.2 g瘤體的瘤體共12例－80℃保存備用。

1.3 熒光定量 PCR檢測Cyclin E和β-actin mRNA的表達。

1.3.1 引物的設計與合成:應用NCBI數據庫，查閱出cyclin E與β-actin的GenBank收錄號分別為NM-007633.2和NM-007393.3，利用Primer5.0設計cyclin E引物，引物序列見表1。

1.3.2 瘤組織總RNA的提取及樣品總RNA反轉錄用Trizol提取組織RNA，具體方法按照Trizol試劑盒說明書進行操作。將提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用蛋白核酸測定儀測定提取的RNA濃度。總RNA的反轉錄過程按照TaKaRa的反轉錄試劑盒說明書進行操作，將反轉錄好的cDNA分裝后－20℃保存備用。

表1 Cyclin E和β-actin PCR基因引物序列

1.3.3 標準曲線樣品的制備:用反轉錄的 cDNA產物制作標準曲線樣品，隨機取提取的1例RNA樣本，用總RNA的反轉錄試劑盒，進行cDNA合成。取反轉錄后樣本的cDNA，進行10倍梯度稀釋(100～10－7)，檢測反應靈敏性，作為制作標準曲線的樣品使用。

1.3.4 熒光定量PCR反應:采用熒光定量PCR法對cyclin E和β-actin進行檢測。將 RNA反轉錄后的cDNA進行擴增10倍梯度稀釋，即取cyclin E和β-actin cDNA(10－2、10－3、10－4、10－5、10－6)梯度稀釋制作標準曲線，ddH2O作陰性對照。定量PCR反應體系:2 ×SYBR Green I Mix 10 μl，上、下游引物各0.8 μl，標準品cDNA 1 μl，加ddH2O 7.4 μl至20 μl反應體系。擴增條件:95℃ 預變性10 s;95℃變性5 s，Cyclin E和β-actin分別53℃、51℃退火20 s，72℃延伸15 s并讀取熒光信號，40個循環，每步的溫度轉換速度是20℃/s;熔解曲線分析:95℃2 s，60℃40 s，以0.2℃/ s加熱至95℃，冷卻至40℃停止。反應結束用Roche LightCycler 1.5分析系統進行結果分析。

1.4 PCR產物特異性、重復性和精密度測量 對熒光定量PCR的熔解曲線進行分析，并將其擴增產物用2.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測PCR產物的長度和反應特異性。將 cyclin E和β-actin 10－4的 cDNA標準品平行操作6次，同時在6 d內分別測定，獲得日間CV和批內CV。

2 結果

2.1 H22肝癌動物模型的建立 將接種瘤細胞的小鼠7天后進行解剖，取瘤體稱重，瘤重在1.5～2.2 g之間，成功的建立了H22肝癌動物模型。

2.2 瘤組織總RNA的提取及PCR產物檢測 將提取的瘤組織總RNA進行A260/280比值和瓊脂糖凝膠電泳檢測，A260/280的比值介于1.7～2.0之間，同時電泳圖顯示有明顯的28 s、18 s和5 s帶型，結果說明提取的總RNA純度和完整性良好。如圖1所示，擴增產物(圖1A)為合成長度(74 bp)的目的基因片段，擴增產物(圖1B)為合成長度(197 bp)的內參基因片段。

2.3 標準曲線的制備 分別取倍比稀釋后(10－2、10－3、10－4、10－5、10－6)的cyclin E和β-actin的cDNA制作PCR擴增曲線、標準曲線和熔解曲線(圖2，圖3)。標準曲線r均為－1.00，說明模板濃度和Ct值相關性良好。二者的標準曲線斜率分別為slop=－3.499和slop=－3.572，PCR擴增效率E=10［－1/slop］－1，對應的擴增效率分別為0.91和0.93，擴增效率高且基本一致;熔解曲線為單峰，說明無引物二聚體生成;擴增曲線梯度良好。

圖1 Cyclin E(A)和β-actin(B)PCR擴增結果

圖3 β－actin熒光定量PCR擴增曲線(A)、標準曲線(B)和熔解曲線(C)

2.4 PCR產物的特異性、重復性與精密度 Cyclin E和β-actin擴增產物對應的Tm值分別為(81.84± 0.28)℃和(89.15±0.26)℃，熔解曲線均呈單峰，說明無引物二聚體生成。SYBR Green I熒光定量PCR方法檢測Cyclin E 10－4cDNA的標準品的批內和日間Ct值的均值分別為28.37和 28.26，標準差分別為0.29和0.41，批內變異系數(CV)和日間CV分別為1.02%和1.45%;β-actin 10－4cDNA的標準品的批內和日間Ct值的均值分別為21.07和21.01，標準差分別為0.19和0.31，批內CV和日間CV分別為0.90%和1.48%。

3 討論

實時熒光定量PCR(FQ-PCR)技術誕生于九十年代中期，因其定量準確，檢測范圍寬，敏感性高，精確度高，無PCR后處理步驟，產出率高且可以進行多重檢測的優點［7］，目前已廣泛應用于分子生物學等諸多研究領域。FQ-PCR的熒光探針法主要有兩大類，一類是非序列特異性熒光染料SYBR Green I法，另一類是可以與目的DNA特異結合的TaqMan探針法。雖然TaqMan探針具有較高的特異性，在許多研究應用中序列特異的熒光探針(如TaqMan)被看作是標準的檢測模式［8，9］，但其合成探針費用昂貴，所以它不適合用于對大量不同基因序列進行定量。SYBR Green I是一種價格低廉的熒光素，它能夠非特異嵌合于DNA雙螺旋結構中，結合狀態的發射熒光。應用SYBR GreenⅠ的熒光定量PCR方法經濟，只需合成序列特異引物。其自身的特異性相對較差及易受引物二聚體影響的缺點，通過摸索優化反應條件，并用熔解曲線和凝膠電泳證實并克服。所以本研究選擇用SYBR Green I作為熒光染料，試圖建立一種方便快捷、特異性高且成本較低的基因定量檢測方法。

本實驗采用將RNA反轉錄產物進行擴增得到的cDNA 10倍梯度稀釋，成功的建立了目的基因和管家基因的雙標準曲線，不需要構建質粒制作標準曲線，在降低實驗成本縮短實驗周期的同時，避免了用膠回收基因片段或質粒載體構建基因片段由于與目標cDNA結構不同所帶來的擴增效率不一致現象。熒光定量PCR的模板定量分相對定量和絕對定量。定量PCR并非完全是測定基因的絕對數量。本研究是采用相對雙標準曲線進行定量分析，選取管家基因β-actin作為參比基因來對所用樣品進行歸一化處理［10］，計算在一定樣本中目的序列相對于另一參照樣本量的變化量。本實驗建立的雙標準曲線法cyclin E基因熒光定量PCR檢測方法標準品的制備方便易得，降低了實驗成本同時較大的減少了系統誤差。

總之，本文建立的檢測小鼠肝癌模型cyclin E mRNA相對表達水平的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方便快捷、經濟實惠、靈敏度高、特異性好，為cyclin E的進一步研究奠定方法學基礎，同時可以推廣應用于到腫瘤學基礎領域相關基因定量研究。

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