BIT1基因在伴淋巴結轉移的食管鱗癌中的表達

柯 洋，范天黎，高 峰，程道博，趙立群

(1.鄭州大學第一附屬醫院消化內科 河南 鄭州 450052;2.鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 河南鄭州 450001;3.鄭州大學醫藥科學研究院 河南鄭州 450052;4.鄭州市中心醫院消化內科 河南鄭州 450007)

食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，食管癌的發生、發展及轉移是一個多因素、多步驟的過程，與細胞凋亡—抗凋亡機制調控失衡密切相關。BIT1(Bcl-2 inhibitor of transcription1)是2004年由Jan等［1］報道并發現的一個蛋白質，該研究認為生理狀態下BIT1蛋白定位于線粒體，當其釋放到胞漿中，則和AES(amino-terminal enhancer of split，AES)［2］結合并誘導了由細胞脫粘附誘發的離巢凋亡，其正常的生理功能尚不清楚。但最新研究表明BIT1蛋白定位于高爾基體［3］，具有抗凋亡功能［4］。目前僅有少量文獻報道BIT1與腫瘤的關系，且結果不盡相同，而BIT1與食管鱗癌的關系，國內外未見報道。

為探討BIT1與食管鱗癌的關系，尤其是與其轉移的關系，本研究采用逆轉錄多聚酶鏈反應技術(reverse trancriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)對30個病例90個組織標本(每個食管鱗癌組織中都有相應的癌旁不典型增生組織及正常食管粘膜組織)中BIT1的基因表達進行PCR擴增及半定量分析，揭示BIT1基因的表達與食管鱗癌轉移的關系，以期為食管鱗癌的治療提供一個新的思路和靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象:30例標本均取自安陽市腫瘤醫院胸外科2010年10月～11月行手術切除的食管癌住院患者。患者術前均未接受化、放療，腫瘤組織經病理學檢查均確診為鱗狀細胞癌。患者中男18例，女12例。年齡45～76歲，平均年齡62.27歲。伴淋巴結轉移10例，無淋巴結轉移20例。6例(淺層組)腫瘤浸潤粘膜層、粘膜下層或淺肌層;24例(深層組)腫瘤浸潤深肌層或外膜層。

1.1.2 組織標本采集:每例標本于離體30 min內分別在無壞死區癌灶、癌旁3 cm以內及遠端正常食管粘膜取材。取材后迅速凍于液氮中，－80℃超低溫冰箱中貯存備用。

1.1.3 引物設計:BIT1引物和內參β-actin引物序列均由北京賽百盛基因技術有限公司合成。BIT1上游引物序列為:5’-ATGCCCTCCAAATCCTT-3’，下游引物序列為5’-ATTAAACTTACAGTCAGTCCC-3’，預期擴增片段大小為428 bp。內參β-actin上游引物為5’-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3’，下游序列為 5’-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’，預期擴增片段大小為315 bp。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取:采用TRIZOL試劑，按照說明提取總RNA，RNA沉淀用20 μl DEPC水溶解。總RNA經紫外分光光度儀檢測260 nm和280 nm的吸光度(A)值，取A260/A280為1.8～2.0者用于RT反應。

1.2.2 半定量RT-PCR反應:以提取的總RNA為模板，按照逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄成cDNA，以β-actin為內參照行PCR擴增反應，反應條件為:94℃預變性2 min;95℃變性1 min，46℃退火1 min，72℃延伸1 min;經30個循環周期后，72℃5 min，取出，4℃貯存備用。PCR產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳(溴化乙錠染色)，用凝膠成像系統分析結果，計算BIT1擴增條帶與β-actin擴增條帶吸光度比值，以其作為BIT1基因的相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS13.0分析軟件處理，根據資料類型采用ANOVA、LSD檢驗和t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測BIT1基因在食管組織中的表達

BIT1及內參β-actin的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳大小與預先設計引物大小一致，其片段大小分別為428 bp、315 bp。凝膠灰度掃描擴增的結果，對BIT1基因的陽性表達進行相對定量，BIT1基因在癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管粘膜組織中的含量依次為1.747±0.243、0.941±0.178、1.242±0.261，經ANOVA檢驗，組間比較差異有統計學意義(F=3.526，P＜0.044)，經LSD檢驗兩兩比較，BIT1基因的表達在癌組織中不典型增生及正常食管粘膜高(均P＜0.05)，BIT1基因的表達在不典型增生及正常食管粘膜中著差無統計學意義(P＞0.05)。見圖1，表1。

圖1 RT-PCR檢測BIT1的表達

表1 BIT1在各種食管組織中的表達(±s)

表1 BIT1在各種食管組織中的表達(±s)

注:A與B相比P=0.020，A與C相比P=0.047，B與C相比P=0.699。

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2.2 食管鱗癌組織中BIT1基因表達與臨床病理學參數的關系 統計學分析表明，在食管鱗癌組織中，BIT1基因的表達水平與患者的性別無明顯相關(P＞0.05)，與腫瘤浸潤深度無明顯相關(P＞0.05)，但BIT1基因的表達水平在淋巴結轉移組明顯高于無淋巴結轉移組，組間差異有統計學意義(P＜0.001);且在TNM分期中差異有顯著的統計學意義，在TNMⅢ/Ⅳ期組中的表達高于Ⅰ/Ⅱ期組(P＜0.05)，見表2。

3 討論

BIT1是2004年Jan等［1］在研究細胞凋亡機制時發現的一種新基因，定位于人17q23.2，其mRNA長度約為1 kb，編碼179aa，BIT1蛋白分子量約為27 kDa。其研究表明，生理狀態下，BIT1蛋白定位于線粒體膜間隙，當BIT1從線粒體釋放到胞漿，或者在胞漿中表達BIT1蛋白時，BIT1與AES結合，共同介導整合素依賴的失巢凋亡。但也有研究表明，BIT1蛋白定位于高爾基體［3］，在粘附細胞中BIT1可通過激活FAK-P13KAFK-NFkB信號通路，上調Bcl-2的轉錄和表達，促進細胞生存，下調內源性的BIT1，則會增強粘附細胞的凋亡［4］。從目前的研究推測，BIT1可能是轉換細胞存活和死亡紐帶的關鍵分子。

表2 食管鱗癌組織中BIT1表達與臨床病理學參數的關系

本研究結果顯示:BIT1基因在癌組織中的表達水平比在癌旁組織、正常食管組織均高，而癌旁組織、正常食管組織相比無統計學意義。BIT1基因表達水平和淋巴結轉移、TNM分期有關，淋巴結轉移組表達水平高于無淋巴結轉移組，Ⅲ/Ⅳ期組表達水平高于Ⅰ/Ⅱ期組，而與患者的性別、年齡、浸潤深度無明顯相關。提示BIT1在淋巴結轉移組中的過表達與食管鱗癌的發展及轉移有關。這一結果可能與BIT1增強整合素α5β1 FAK的活化，通過激活FAK-P13K-AFK-NFkB信號通路上調NFkB的活性，隨之上調Bcl-2的表達有關［4］，從而促進轉移的癌細胞克服離巢凋亡而存活。已有研究表明，Bcl-2和FAK的過表達會增加腫瘤的轉移效率［5］;BIT1在卵巢癌組織中的表達明顯高于正常卵巢組織，卵巢癌組織中BIT1的表達與病理分級密切相關［6］。但也有研究與之相反，例如Karmal等［7］認為在晚期乳腺癌組織中BIT1表達下調，下調BIT1可降低細胞失巢凋亡的敏感性，增強細胞粘附，增強轉移和高水平的ErK活化，促進細胞抗凋亡及轉移能力;滑瑋［8］等認為BIT1在宮頸癌組織中的表達明顯低于正常宮頸組織，宮頸癌組織中BIT1的表達與分化程度密切相關。這些研究與本實驗結果存在差異，其原因可能與取材和檢測水平有關。

綜上所述，BIT1在伴淋巴結轉移食管鱗癌組織中的高表達提示BIT1在食管鱗癌的轉移中可能起一定作用。而二者之間的確切關系有待于進一步研究。

［1］ Jan Y W，Matter M，Pai J T，et al.A mitochondrial protein，BIT1，mediates apoptosis regulated by integrins and Groucho/TLE corepressors［J］.Cell，2004，116(5):751-762.

［2］ Paroush Z，Finley R J，Kidd T，et al.Groucho is required for Drosophila neurogenesis，segmentation，and sex determination and interacts diretly with hairy-related bHLH proteins［J］.Cell，1994，79(5): 805-815.

［3］ Yi P，Nguyen D T，Higa-Nishiyama A，et al.MAPK scaffolding by BIT1 in the Golgi complex modulates stress resistance［J］.Journal of Cell Science，2010，123(7):1067-1072.

［4］ Griffiths G S，Grundl M，Leychenko A，et al.Bit-1 mediates integrindependent cell survival through activation of the NFkappaB pathway［J］.Journal of Biological Chemistry，2011，86(16):14713-14723.

［5］ Townson J L，Naumov G N，Chambers A F，et al.The role of apoptosis in tumor progression and metastasis［J］.Curr Mol Med，2003，3(7): 631-642.

［6］ 滑瑋，辛曉燕，張偉，等.應用組織芯片技術分析卵巢癌組織中BIT1基因的表達［J］.現代婦科腫瘤，2006，15(3):181-183.

［7］ Karmali P P，Brunquell C，Tram H，et al.Metastasis of tumor cells is enhanced by downregulation of BIT1［J］.PloS one，2011，6 (8):23840.

［8］ 滑瑋，呂海鵬，辛曉燕，等.應用組織芯片技術分析宮頸癌組織中Bit 1基因的表達［J］.現代腫瘤醫學，2007，15(6):832-834.