SISH檢測乳腺癌HER2基因及17號染色體倍體分析

楚廣民，白睿華，張建波，孫淼淼，于慶凱

(河南省腫瘤醫(yī)院病理科 河南鄭州 450008)

人類表皮生長因子受體2(HER2)基因是人類原位基因，其過表達(dá)不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而且是評估臨床預(yù)后的重要指標(biāo)［1］。免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)診斷HER2狀態(tài)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)、試劑及客觀的評價標(biāo)準(zhǔn)。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)診斷HER2狀態(tài)需要長時間的染色和評分及熒光顯微鏡，并且熒光染料淬滅時信號會丟失。銀增強原位雜交(silver enhanced in situ hybridization，SISH)檢測HER2基因擴增，能得到永久染色的玻片并可在亮視野中觀察判斷。根據(jù)國外研究報道，在乳腺癌中，SISH與FISH檢測HER2基因擴增的符合率達(dá)94%～99%［2-4］。本研究應(yīng)用SISH技術(shù)對90例術(shù)前均未進(jìn)行放療化療的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌手術(shù)切除標(biāo)本檢測HER2基因的擴增情況，目的在于總結(jié)操作經(jīng)驗，優(yōu)化操作方法，對這項新技術(shù)的可行性進(jìn)行初步評估。

1 材料與方法

1.1 材料 選取河南省腫瘤醫(yī)院2010年10月至2011年12月手術(shù)切除乳腺癌標(biāo)本90例，患者術(shù)前均未接受過放療及化療。標(biāo)本離體后30 min內(nèi)用10%中性緩沖甲醛液固定16～18 h，病理學(xué)檢查確診為浸潤性導(dǎo)管癌。90例標(biāo)本均行IHC染色、FISH和SISH檢測HER2的蛋白表達(dá)和基因狀態(tài)。

1.2 方法

1.2.1 IHC染色:全自動IHC檢測，使用Benchmark XT全自動 IHC系統(tǒng)及其配套試劑，一抗為 Anti—HER2/neu(4B5，Ventana公司，美國)，使用UltraView DAB試劑盒，嚴(yán)格按照Roche診斷優(yōu)化程序執(zhí)行，常規(guī)封片。

1.2.2 FISH檢測:所用 PathVysion HER2DNA探針試劑盒購于VYSIS公司，蛋白酶K購于MERCK公司。熒光顯微鏡為Olympus公司BX51型號及專用的FISH圖像分析軟件。檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒推薦的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。

1.2.3 SISH檢測:在Benchmark XT全自動切片染色機上進(jìn)行，所用試劑購自美國Roche公司，包括INFORM HER2 DNA探針、17號染色體(Chrl7)DNA探針、Ventana uhra ViewTMSISH檢測試劑盒以及輔助試劑。操作步驟及參數(shù)設(shè)置按照操作手冊及試劑說明書。常規(guī)封片，光鏡觀察。

1.3 結(jié)果判讀

1.3.1 IHC染色評分:采用國際公認(rèn)的ASCO/CAP指南推薦的評分系統(tǒng)。

1.3.2 FISH:選擇細(xì)胞核大小一致，胞核邊界完整、DAPI染色均一、細(xì)胞核無重疊、Chrl7綠色信號清晰的細(xì)胞，隨機計數(shù)至少30個癌細(xì)胞核中的雙色信號。HER2基因狀態(tài)判讀標(biāo)準(zhǔn):HER2/Chr17比值＜1.8提示無擴增;比值＞2.2提示HER2基因擴增。若比值位于1.8～2.2之間，則 HER2基因擴增不確定。Chr17倍體判讀標(biāo)準(zhǔn):綠色信號定位于17號染色體的著絲粒，計算綠色熒光信號為Chr17倍體情況，根據(jù)信號數(shù)目可分為單體，雙體和多體(細(xì)胞核中綠色信號＞2)。

1.3.3 SISH:HER2基因為黑色信號，Chrl7為紅色信號，其判讀標(biāo)準(zhǔn)同F(xiàn)ISH。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，進(jìn)行χ2檢驗及Kappa一致性檢驗，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SISH與IHC和FISH法檢測HER2的結(jié)果比較 IHC檢測90例患者中，HER2蛋白表達(dá)陽性(3 +)的25例中FISH檢測23例(92%)為HER2基因擴增，SISH檢測24例(96%)為HER2基因擴增;蛋白表達(dá)不確定(2+)的19例中FISH檢測7例(36%)為HER2基因擴增，2例(10%)為基因擴增不確定，SISH檢測8例(42%)為HER2基因擴增，1例(5%)為基因擴增不確定;蛋白表達(dá)陰性(1+/0)的46例FISH檢測均為基因無擴增，SISH檢測也均為基因無擴增。總體符合率為96%。結(jié)果見表1。

表1 IHC、FISH與SISH方法檢測乳腺癌HER2的結(jié)果比較

2.2 FISH法檢測Chr17的結(jié)果 FISH法檢測Chr17的結(jié)果見表2。90例乳腺癌標(biāo)本中，Chr17多體在IHC(3+)、(2+)、(1+/0)3組中的發(fā)生率分別為44%，26%和0.02%，其總的發(fā)生率為18%。3組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.36，P＜0.01)。

表2 IHC法檢測HER2蛋白與FISH法檢測Chr17的結(jié)果

2.3 HER2基因擴增與Chr17的關(guān)系 FISH法檢測Chr17結(jié)果顯示:30例HER2基因擴增的病例中Chr17多體有12例(40%);在58例HER2基因無擴增的病例中只有1例Chr17是多體(0.01%)。見表3。

表3 FISH檢測HER2基因擴增與Chr17的關(guān)系

3 討論

2007年ASCO/CAP推薦乳腺癌HER2狀態(tài)檢測可選IHC和FISH。對于多數(shù)病理科來說，IHC檢測HER2蛋白表達(dá)是常規(guī)首選，但I(xiàn)HC技術(shù)影響因素較多，包括抗體的選擇、抗原修復(fù)方法等。醫(yī)院間結(jié)果差異較大，存在大量假陽性或假陰性的結(jié)果，因此無法準(zhǔn)確評估HER2基因的擴增狀況。FISH用于HER2原癌基因核酸水平的檢測具有高敏感性及穩(wěn)定性，但其熒光衰變速度快，結(jié)果難以長期保存，且需要配備昂貴的熒光顯微鏡及專用圖像分析系統(tǒng)，普及開展有一定困難。

SISH是近年發(fā)展起來的一種基因檢測新技術(shù)，通過使用先進(jìn)的銀沉淀技術(shù)，能夠得到非常精確的色素信號，也是目前唯一的全自動原位雜交分析方法。作為一項新技術(shù)，SISH能被廣泛接受的前提條件是它必須與目前的“金標(biāo)準(zhǔn)”FISH有很高的符合率。2007年ASCO/CAP提出的標(biāo)準(zhǔn)是新技術(shù)檢測結(jié)果與FISH的符合率應(yīng)達(dá)到95%以上［5］。本研究結(jié)果表明SISH檢測可滿足上述條件:SISH和FISH檢測乳腺癌HER2基因擴增狀態(tài)的符合率達(dá)到96%，與文獻(xiàn)報道的符合率94%～99%［3，6］相近。由此可見，SISH與FISH檢測之間具有非常好的一致性，并且多個病理醫(yī)師依據(jù)HER2基因信號與Chr17信號之比對SISH檢測結(jié)果的解釋具有很好的重復(fù)性。對于疑難病例的標(biāo)本，病理醫(yī)師可在多頭顯微鏡下同時觀察，逐個細(xì)胞進(jìn)行討論，從而很容易達(dá)到共識。SISH還具有在光鏡下觀察就能判斷結(jié)果的優(yōu)勢，檢測信號很容易觀察。可同時觀察組織形態(tài)，而檢測耗時只是FISH檢測所需時間的一半。因此，SISH完全可以作為常規(guī)檢測技術(shù)用于乳腺癌的HER2基因擴增狀態(tài)檢測。

Chr17異常在乳腺癌中是常見的。Risio M等認(rèn)為Chr17單體的患者對曲妥珠單抗治療的反應(yīng)差。Watters AD等［7］認(rèn)為具有Chr17多體的患者預(yù)后不良。另外還有部分研究者認(rèn)為Chr17多體性是導(dǎo)致IHC(2+和3+)但FISH陰性的主要原因。本研究中，Chr17多體的發(fā)生率在IHC3組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Chr17多體的發(fā)生與HER2蛋白的過度表達(dá)有關(guān); Chr17多體在HER2基因擴增組明顯高于無擴增組，Chr17多體的發(fā)生率與HER2基因的擴增有關(guān)。由此可見Chr17多體可能與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)，在評價HER2基因狀態(tài)的同時應(yīng)該考慮Chr17倍體的變化情況，從而為臨床篩選靶向藥物及選擇治療方案提供客觀、準(zhǔn)確的依據(jù)。

［1］ 王曉蘭，姚凡，劉楠，等.FISH在乳腺癌組織HER2/neu原癌基因檢測上的應(yīng)用及其臨床意義的研究［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，37(5):664-666.

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［4］ Papouchado B G，Myles J，Lloyd R V，et a1.Silver in situ hybridization(SISH)for determination of HER2 gene status in breast carcinoma:comparison with FISH and assessment of interobserver reproducibility［J］.Am J Surg Pathol，2010，34(6):767-776.

［5］ Wolff A C，Hammond M E，Schwartz J N，et Al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer［J］.J Clin Oncol，2007，25:118-145.

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