靈芝對(duì)肝癌干細(xì)胞糖代謝和標(biāo)志物蛋白的影響

安玉會(huì)，王潔瓊，徐 衍，崔海濤，馬乾坤，李芳芳，何一昕

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 河南鄭州 450001)

1980年至2005年，全球癌癥的年發(fā)病人數(shù)增加了1倍，從600萬(wàn)人上升到1 200萬(wàn)人［1］。據(jù)1999年的統(tǒng)計(jì)，肝癌的病死率在各種癌癥中排第4位，在男性則為第3位，共有42.7萬(wàn)人死于肝癌［2］。肝癌在世界人口的標(biāo)化死亡率為17.72/10萬(wàn)，在中國(guó)人口的標(biāo)化死亡率為13.45/10萬(wàn)［3］。

盡管化療藥物可以快速縮小腫瘤的體積，但治療后的復(fù)發(fā)仍高比率的出現(xiàn)于腫瘤病人中。其根本原因是這些化療藥物在根除癌干細(xì)胞方面是低效率的。新的研究發(fā)現(xiàn)，天然存在的營(yíng)養(yǎng)性化合物為癌的化學(xué)預(yù)防提供了可能［4］，因?yàn)樗鼈兡苤苯踊蜷g接地影響癌干細(xì)胞的增殖途徑［5］。對(duì)靈芝的抗癌作用研究表明，靈芝能抑制癌的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，具有良好的腫瘤化學(xué)防治作用［6］，但抑制機(jī)理不明，是否是靈芝對(duì)癌干細(xì)胞發(fā)揮了作用，尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。本文報(bào)告靈芝對(duì)人肝癌細(xì)胞中己糖激酶活性和肝癌干細(xì)胞中CD133蛋白的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞分組并進(jìn)行藥物處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌SMMC7721細(xì)胞進(jìn)行96孔鋪板，每孔接種細(xì)胞104個(gè)。細(xì)胞貼壁后，分別用不同濃度(100、200、300、400、500 μg/ml)的靈芝L08處理24 h、48 h、72 h。其中每種藥物每個(gè)濃度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，設(shè)置一個(gè)對(duì)照組和100、200、300、400、500 μg/ml的陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺組)。

1.2 腫瘤細(xì)胞抑制率的測(cè)定 將加藥處理24 h、48 h、72 h后的肝癌SMMC7721細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MTT (5 mg/ml)，每孔20 μl，孵育4 h。終止孵育時(shí)，小心棄去孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl的DMSO，利用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定其OD值。抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-加藥處理組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.3 己糖激酶活性測(cè)定的測(cè)定 處理細(xì)胞后終止培養(yǎng)，破裂細(xì)胞。按照己糖激酶試劑盒操作流程進(jìn)行加樣，混勻，記錄30 s時(shí)340 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A1值)，將比色皿中的反應(yīng)液倒入預(yù)先編號(hào)的試管中，放入37℃水浴20 min，測(cè)定20 min30 s的吸光度(A2值)。HK活性(U/g protein)=(A2－A1)/毫摩爾消光系數(shù)×1/(反應(yīng)時(shí)間×比色光徑)×反應(yīng)體系中樣本稀釋倍數(shù)×1 000。

1.4 CD133蛋白的測(cè)定方法 收集處理24 h后的細(xì)胞反復(fù)凍融并離心。收集上清液測(cè)定蛋白含量。取蛋白樣品，加入等量的loading buffer。振蕩混勻，煮沸5 min，離心后110 V電泳至膠下緣。取膠，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h。洗膜3次后加入一抗(1 μg/ml)。洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(即二抗)，室溫孵育1 h。洗膜并用辣根過(guò)氧化酶-DAB法染色。出現(xiàn)明顯的棕色蛋白條帶停止染色。用灰度儀掃描棕色蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 MTT和己糖激酶活性測(cè)定所得的數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組分別同陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。不同藥物濃度的組內(nèi)進(jìn)行F檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)用±s表示。組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 靈芝L08對(duì)細(xì)胞增殖的抑制 靈芝L08對(duì)人肝癌SMMC7721細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。與化療藥物環(huán)磷酰胺比，200 μg/ml以下濃度的靈芝L08作用人肝癌SMMC7721細(xì)胞24 h，其抑制率低于環(huán)磷酰胺。但作用時(shí)間超過(guò)48 h以上，200 μg/ml的靈芝L08均比同樣濃度的環(huán)磷酰胺對(duì)人肝癌SMMC7721細(xì)胞的增殖具有更強(qiáng)的抑制作用。并且，隨著靈芝L08濃度和作用時(shí)間的增加，其抑制率更高。不同濃度的靈芝L08和環(huán)磷酰胺對(duì)細(xì)胞增殖作用的抑制率，見(jiàn)表1～3。

表1 靈芝L08和環(huán)磷酰胺對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞處理24 h增殖的影響(±s)

表1 靈芝L08和環(huán)磷酰胺對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞處理24 h增殖的影響(±s)

靈芝L08組總F=25.41，P＜0.05;環(huán)磷酰胺組總F=22.45，P＜0.05。

?

表2 靈芝L08和環(huán)磷酰胺對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞處理48 h增殖的影響(±s)

表2 靈芝L08和環(huán)磷酰胺對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞處理48 h增殖的影響(±s)

靈芝L08組總F=53.37，P＜0.05;環(huán)磷酰胺組總F=32.11，P＜0.05。

?

表3 靈芝L08和環(huán)磷酰胺對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞處理72 h增殖的影響(±s)

表3 靈芝L08和環(huán)磷酰胺對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞處理72 h增殖的影響(±s)

靈芝L08組總F=24.28，P＜0.05;環(huán)磷酰胺組總F=57.16，P＜0.05。

抑制率(%)組別 n OD值0.58±0.024 0.54±0.021 0±0.025 0±0.020 100 μg/ml 6 0.50±0.032 0.48±0.016 17.27±0.027 14.01±0.017 200 μg/ml 6 0.45±0.018 0.44±0.012 25.21±0.020 20.83±0.020 300 μg/ml 6 0.39±0.062 0.35±0.025 37.53±0.045 41.31±0.023 400 μg/ml 6 0.22±0.039 0.26±0.017 71.64±0.037 60.72±0.018 500 μg/ml 6 0.12±0.006 0.14±0.025 92.20±0.010 86.環(huán)磷酰胺正常對(duì)照靈芝L08環(huán)磷酰胺 靈芝L08 6 63±0.022

2.2 靈芝L08對(duì)己糖激酶活性的抑制 靈芝L08和環(huán)磷酰胺均能降低人肝癌SMMC7721細(xì)胞己糖激酶的活性。隨著靈芝L08和環(huán)磷酰胺濃度的增加，它們對(duì)己糖激酶的抑制率也逐步增加。但隨著它們對(duì)細(xì)胞作用時(shí)間的增加，各濃度對(duì)應(yīng)組的抑制作用則逐步降低。不同濃度的靈芝L08和環(huán)磷酰胺對(duì)細(xì)胞中己糖激酶的抑制率，見(jiàn)表4～6。

表4 靈芝L08和環(huán)磷酰胺處理肝癌SMMC7721細(xì)胞24 h對(duì)己糖激酶活性的影響(±s)

表4 靈芝L08和環(huán)磷酰胺處理肝癌SMMC7721細(xì)胞24 h對(duì)己糖激酶活性的影響(±s)

抑制率(%)組別 n OD值0.277±0.011 0.689±0.031 0±0.016 0±0.027 100 μg/ml 6 0.232±0.026 0.573±0.023 16.3±0.023 16.9±0.021 200 μg/ml 6 0.227±0.025 0.567±0.026 18.1±0.021 17.8±0.023 300 μg/ml 6 0.221±0.016 0.548±0.018 20.3±0.020 20.5±0.020 400 μg/ml 6 0.209±0.019 0.536±0.030 24.6±0.017 22.3±0.025 500 μg/ml 6 0.196±0.023 0.531±0.016 29.3±0.024 23環(huán)磷酰胺正常對(duì)照靈芝L08環(huán)磷酰胺 靈芝L08 6.0±0.017

靈芝L08組總F=27.89，P＜0.05;環(huán)磷酰胺組總F=45.31，P＜0.05。

表5 靈芝L08和環(huán)磷酰胺處理肝癌SMMC7721細(xì)胞48 h對(duì)己糖激酶活性的影響(±s)

表5 靈芝L08和環(huán)磷酰胺處理肝癌SMMC7721細(xì)胞48 h對(duì)己糖激酶活性的影響(±s)

靈芝L08組總F=32.36，P＜0.05;環(huán)磷酰胺組總F=27.03，P＜0.05。

抑制率(%)組別 n OD值0.265±0.019 0.667±0.018 0±0.020 0±0.019 100 μg/ml 6 0.230±0.016 0.562±0.026 13.3±0.017 15.8±0.023 200 μg/ml 6 0.222±0.014 0.558±0.017 16.3±0.018 16.4±0.018 300 μg/ml 6 0.216±0.024 0.550±0.024 18.5±0.022 17.6±0.022 400 μg/ml 6 0.204±0.013 0.533±0.019 23.1±0.016 20.1±0.020 500 μg/ml 6 0.194±0.027 0.530±0.036 26.8±0.024 20環(huán)磷酰胺正常對(duì)照靈芝L08環(huán)磷酰胺 靈芝L08 6.6±0.027

表6 靈芝L08和環(huán)磷酰胺處理肝癌SMMC7721細(xì)胞48 h對(duì)己糖激酶活性的影響(±s)

表6 靈芝L08和環(huán)磷酰胺處理肝癌SMMC7721細(xì)胞48 h對(duì)己糖激酶活性的影響(±s)

靈芝L08組總F=25.75，P＜0.05;環(huán)磷酰胺組總F=35.38，P＜0.05。

抑制率(%)組別 n OD值0.263±0.016 0.660±0.034 0±0.017 0±0.027 100 μg/ml 6 0.227±0.013 0.559±0.033 13.7±0.016 15.4±0.025 200 μg/ml 6 0.219±0.019 0.556±0.028 16.8±0.020 15.8±0.023 300 μg/ml 6 0.214±0.013 0.548±0.023 18.7±0.023 17.0±0.022 400 μg/ml 6 0.201±0.014 0.534±0.030 23.6±0.020 19.1±0.024 500 μg/ml 6 0.194±0.023 0.531±0.036 26.3±0.024 19環(huán)磷酰胺正常對(duì)照靈芝L08環(huán)磷酰胺 靈芝L08 6.6±0.025

2.3 靈芝L08對(duì)SMMC772細(xì)胞CD133蛋白水平的影響 靈芝L08能降低癌干細(xì)胞的標(biāo)志物蛋白CD133的水平，并且隨著靈芝濃度的增加，CD133蛋白的水平顯著降低。環(huán)磷酰胺也能少量降低CD133蛋白的水平，但隨著環(huán)磷酰胺濃度的增加，CD133蛋白的水平并沒(méi)有明顯的改變。不同濃度的靈芝L08和環(huán)磷酰胺對(duì)肝癌干細(xì)胞中CD133蛋白水平的影響見(jiàn)圖1、圖2和表7。

表7 靈芝L08和環(huán)磷酰胺處理SMMC772細(xì)胞后CD133蛋白條帶的灰度值(±s)

表7 靈芝L08和環(huán)磷酰胺處理SMMC772細(xì)胞后CD133蛋白條帶的灰度值(±s)

靈芝L08組總F=215.88，P＜0.05;環(huán)磷酰胺組總F=82.21，P＜0.05。

P組別 n 環(huán)磷酰胺空白對(duì)照組灰度值靈芝L08環(huán)磷酰胺 靈芝L08 3 348.25±7.993 354.75±9.205 100 μg/ml 3 257.50±8.510 249.00±5.401 0.000 0.000 200 μg/ml 3 202.25±6.156 234.75±5.360 0.000 0.000 400 μg/ml 3 101.00±4.916 246.25±3.198 0.000 0.000

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靈芝 L08能抑制人肝癌SMMC7721細(xì)胞的增殖。隨著濃度和時(shí)間的增加，靈芝L08比同樣濃度的環(huán)磷酰胺對(duì)細(xì)胞的抑制率更高。腫瘤組織即使在氧供應(yīng)充分的條件下也主要以無(wú)氧糖酵解獲取能量［7］，而己糖激酶是催化無(wú)氧糖酵解第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶［8］。靈芝L08能抑制人肝癌細(xì)胞己糖激酶的活性，從而可抑制癌細(xì)胞通過(guò)無(wú)氧糖酵解獲取增殖的能量，阻止人肝癌細(xì)胞的增殖。

Suetsugu等［9］證實(shí)，CD133蛋白陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞具有癌干細(xì)胞樣的性質(zhì)。Lingala等［10］證明在肝細(xì)胞癌表面存在著CD133蛋白。在先前的研究中，作者也證實(shí)人肝癌SMMC7721細(xì)胞系中存在著CD133陽(yáng)性的癌干細(xì)胞［11］。靈芝 L08降低人肝癌干細(xì)胞的CD133蛋白的水平，一方面表明靈芝L08抑制了人肝癌干細(xì)胞的CD133基因的表達(dá)，因此降低了CD133蛋白水平。可能靈芝L08抑制了人肝癌干細(xì)胞的增殖，減少了人肝癌干細(xì)胞數(shù)，因此CD133蛋白水平有了明顯降低。但是，靈芝是因?yàn)橐种屏薈D133基因的表達(dá)才阻止了肝癌干細(xì)胞的增殖，還是抑制了肝癌干細(xì)胞增殖才降低了CD133蛋白的水平，須要進(jìn)一步研究。但可以肯定肝癌干細(xì)胞增殖的抑制和減少，阻止了癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)可能。

在中國(guó)、日本、朝鮮和亞洲許多國(guó)家，靈芝曾被用作傳統(tǒng)藥物治療多種疾病［12］。對(duì)靈芝的抗癌作用研究表明，靈芝能抑制癌細(xì)胞的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，具有良好的腫瘤化學(xué)預(yù)防作用［6］。本研究的結(jié)果表明，靈芝可抑制肝癌細(xì)胞己糖激酶的活性，因而也就抑制了肝癌細(xì)胞和癌干細(xì)胞增殖的能量來(lái)源。同時(shí)，靈芝也降低了CD133蛋白的水平，抑制了癌干細(xì)胞的增殖。靈芝作為公認(rèn)的傳統(tǒng)草藥在癌的預(yù)防和治療中必將發(fā)揮更大的作用。

［1］ Sasco A J.Cancer and globalization［J］.Biomedicine and Pharmacotherapy，2008，62(2):110-121.

［2］ 張思維，雷正龍，李光琳，等.中國(guó)腫瘤登記地區(qū)2006年腫瘤發(fā)病和死亡資料分析［J］.中國(guó)腫瘤，2010，19(6):356-365.

［3］ 毛鎖寶.2003年-2007年原發(fā)性肝癌的發(fā)病率及相關(guān)因素分析［J］.中外醫(yī)學(xué)研究，2009，7(14):170-171.

［4］ Koch U，Krause M，Baumann M.Cancer Stem cells at the crossroads of current cancer therapy failure-Radiation oncology perspective［J］.Seminars in Cancer Biology，2010，20(2):116-124.

［5］ Li Y Y，Wicha M S，Schwartz S J，et al.Implications of cancer stem cell theory for cancer chemoprevention by natural dietary compounds［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2011，22(9):799-806.

［6］ Weng C J，Yen G C.The in vitro and in vivo experimental evidences disclose the chemopreventive effects of Ganoderma lucidum on cancer invasion and metastasis［J］.Clin Exp Metastasis，2010，27(5):361-369.

［7］ 趙迎超，伍鋼.己糖激酶與惡性腫瘤的關(guān)系研究進(jìn)展［J］.腫瘤防治研究，2006，33(9):694-696.

［8］ Miller S，Ross-Inta C，Giulivi C.Kinetic and proteomic analyses of S-nitrosoglutathione-treated hexokinase A:consequences for cancer energy metabolism［J］.Amino Acids，2007，32(4):593-602.

［9］ Suetsugu A，Nagaki M.Characterization of CD133+hepatocellular carcinoma cells as cancer stem/progenitor cells［J］.Biochem and Biophys Res Comm，2006，351(4):820-824.

［10］Lingala S，Cui Y Y，Chen X L，et al.Immumohistochemical staining of cancer cell markers in hepatocellular carcinoma［J］.Experimental and Molecular Pathology.2010，89(1):27-35.

［11］安玉會(huì)，宋丹，楊麗君，等.大豆黃酮對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞和CD133腫瘤干細(xì)胞增殖的影響［J］.河南醫(yī)學(xué)研究，2010，19 (4):385-388.

［12］Li Y Q，Wang S F.Anti-hepatitis B activities of ganoderic acid from Ganoderma lucidum［J］.Biotechnol Lett，2006，28(11):837-841.