食管鱗狀細胞癌中血管內皮生長因子C mRNA的表達及其臨床意義*

馬 俊， 魯建軍， 鄒健勇， 顧 勇， 鐘佛添

(中山大學附屬第一醫院胸外科，廣東廣州510080)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在世界范圍內存在著地區、種族和病理類型的差異。我國是食管癌高發國家，其中90%以上為鱗狀細胞癌［1］。食管鱗狀細胞癌顯著的生物學特性表現為腫瘤早期往往出現淋巴結轉移，腫瘤侵犯黏膜下層時即可發生廣泛和跳躍性淋巴結轉移。血管內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF－C)是作用于淋巴上皮細胞中血管內皮生長因子受體3(vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR－3)的細胞因子，VEGF－C在食管癌淋巴管形成、淋巴結侵犯和轉移中起重要作用［2］。本研究通過原位雜交法檢測VEGF－C mRNA在食管鱗狀細胞癌組織及正常食管組織中的表達，探討其表達的臨床意義。

對象和方法

1 研究對象

標本取自中山大學附屬第一醫院胸外科2009年3月至2010年2月經手術切除的新鮮食管鱗狀細胞癌組織以及癌旁5 cm以上正常食管組織39例，切取后立即置于液氮中暫存，然后－80℃低溫冰箱中保存。所有標本均經臨床及病理組織學檢查確診，患者術前未行化、放療。其中男性34例，女性5例。年齡44～83歲，平均(59.9±9.64)歲。按2009年第7版食管癌國際分期，T2組9例，T3組30例;有淋巴結轉移14例，無淋巴結轉移25例。低分化13例，中高分化26例。

2 主要試劑

VEGF－C原位雜交試劑盒、原位雜交專用蓋玻片及原位雜交PBS購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。其它生化試劑均為國產分析純。

3 原位雜交過程

低溫冰箱取出標本后馬上予以固定1 h。固定液為4%多聚甲醛 +0.1 mol/L PBS(pH 7.0～7.6)，含有1/1000 DEPC。常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6 μm。石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫10 min以滅活內源性酶，蒸餾水洗3次。切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37℃消化10 min。原位雜交用PBS洗3次×5 min。蒸餾水洗1次。用1%多聚甲醛+0.1 mol/L PBS(pH 7.2～7.6，含有1/1 000 DEPC)室溫后固定10 min。蒸餾水洗滌3次。干的雜交盒底部加20%甘油20 mL以保持濕度。按每張切片20 μL加預雜交液。恒溫箱40℃ 4 h。吸取多余液體，不洗。按每張切片20 μL雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱40℃雜交過夜。揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2× SSC洗滌5 min×2次;37℃ 0.5×SSC洗滌15 min;37℃0.2×SSC洗滌15 min×3次。滴加封閉液37℃ 30 min。甩去多余液體，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛37℃60 min。原位雜交用PBS洗5 min×4次。滴加SABC 37℃20 min。原位雜交用PBS洗5 min×3次。滴加生物素化過氧化物酶37℃20 min。原位雜交用PBS洗5 min×4次。使用DAB顯色試劑盒:1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標本上。顯色20 min。充分水洗。蘇木素復染，充分水洗。酒精脫水，二甲苯透明，封片。觀察VEGF－C mRNA表達情況，分為陽性組和陰性組。

4 統計學處理

用SPSS 19.0統計軟件進行分析并繪制生存曲線。VEGF－C mRNA陽性率的比較采用χ2檢驗，生存率的比較采用log－rank檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 食管鱗癌組織與正常食管組織VEGF－C mRNA表達情況

VEGF－C mRNA表達陽性的細胞胞漿著色呈棕黃色，見圖1A，VEGF－C mRNA表達陰性的細胞胞漿無棕黃色著色，見圖1B。在39例食管鱗狀細胞癌組織中，28例(71.8%) VEGF－C mRNA表達陽性，正常食管組織中5例(12.8%)表達陽性。兩者比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

Figure 1.Results of in situ hybridization for the expression of VEGF－C mRNA.A:positive group(tumor tissue); B:negative group(non－tumor tissue).圖1VEGF－C mRNA表達情況

表1 食管組織中VEGF－C mRNA表達情況Table 1 .The expression of VEGF－C mRNA in tumor tissues and non－tumor tissues(n=39)

2 食管鱗癌組織中VEGF－C mRNA表達與腫瘤浸潤和淋巴結轉移的關系

VEGF－C mRNA表達陽性率在T3組顯著高于T2組(80.0%vs 44.4%，P＜0.05)，在有淋巴結轉移組顯著高于無淋巴結轉移組(92.9%vs 60.0%，P＜0.05)。而在年齡分組(70.6%vs 75.0%)、性別分組(68.4%vs 80.0%)及腫瘤分化程度分組(65.4%vs 84.6%)之間無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

表2 腫瘤組織VEGF－C mRNA表達與臨床病理參數的關系Table 2 .Relationship between clinicopathological parameters and expression of VEGF－C mRNA in tumor tissues

3 食管鱗癌組織中VEGF－C mRNA表達情況與患者預后的關系

隨訪至死亡或2012年2月29日(以先者為準)，VEGFC mRNA表達陽性組患者生存率低于陰性組［46.4%(13/ 28)vs 81.8%(9/11)，P＜0.05］，見圖2。

Figure 2.Survival curves of the two groups.圖2 兩組患者的生存曲線

討論

食管鱗狀細胞癌的生長與轉移依賴腫瘤相關血管、淋巴管提供養分、氧氣和轉移通道，其顯著的生物學特性表現為腫瘤早期往往出現淋巴結轉移，腫瘤侵犯黏膜下層時即可發生廣泛和跳躍性淋巴結轉移。腫瘤轉移是一個多步驟、多階段、多基因的復雜過程，其中腫瘤組織的血管生成及淋巴管生成是必不可少的環節。腫瘤血管、淋巴管生成受腫瘤細胞和宿主細胞產生和釋放的多種血管、淋巴管生成因子和生成抑制因子共同調控。

VEGF－C是VEGF家族中的一員，是迄今為止唯一的血管、淋巴管內皮細胞刺激因子，通過其受體2(KDR)及受體3 (Flt－4)分別作用于血管和淋巴管上皮，促進腫瘤的生長和轉移［3］。VEGF－C主要通過作用于VEGFR－3受體促進淋巴管內皮細胞的增殖和遷移，從而發揮淋巴管新生的作用而促進腫瘤淋巴轉移［4］。Duff等［5］研究表明VEGF－C mRNA表達增加在上皮惡性腫瘤淋巴結轉移、擴散中起重要作用。Isaka等［6］的研究顯示過量表達VEGF－C導致腫瘤周圍淋巴管異常增生，使腫瘤組織更易通過淋巴管轉移。VEGF－C作為新生淋巴管的重要調控因子的作用已得到共識。

近年來，通過對VEGF－C在人腫瘤中的表達及其與腫瘤淋巴結轉移之間的關系做了大量研究，表明VEGF－C表達與消化道腫瘤淋巴管生成和淋巴結轉移相關。Furudoi等［7］應用免疫組化法檢測152例進展期結直腸癌組織的VEGF－C表達，發現VEGF－C表達與淋巴管侵犯、淋巴結轉移和浸潤深度有關，并用多因素分析方法證明VEGF－C表達和淋巴結轉移是影響5年生存率的獨立因素。對胃癌標本進行檢測發現VEGF－C的表達與淋巴管密度明顯相關，提示VEGF－C與胃癌淋巴管生成密切相關。此外，在鼻咽癌［8］、乳腺癌［9］、非小細胞肺癌［10］、腦膠質瘤［11］等實體腫瘤組織中均檢測到高表達的VEGF－C mRNA，其表達明顯高于正常組織，并與淋巴管形成、淋巴結轉移及預后密切相關。

本實驗采用原位雜交的方法檢測食管鱗癌組織及正常食管組織中VEGF－C mRNA的表達，發現食管鱗癌中VEGF－C mRNA表達明顯高于正常食管組織，表明腫瘤組織中可能通過某些途徑促進VEGF－C mRNA的表達。本組資料顯示VEGF－C mRNA陽性表達率與患者T分期有密切的相關性。T3分期組的VEGF－C mRNA的表達陽性率顯著高于T2分期組，提示VEGF－C與腫瘤浸潤深度有關，與Takala等［12］的結論相符，可能與VEGF－C增強腫瘤侵襲能力、抑制細胞凋亡有關。本組資料顯示有淋巴結轉移患者的VEGFC mRNA表達率明顯高于無淋巴結轉移者，與Tanaka等［13］的研究結果相符。提示VEGF－C可能引起腫瘤周圍淋巴管增生，或誘導腫瘤內淋巴管形成，從而使腫瘤細胞通過淋巴管進行轉移擴散的概率增大。本組數據顯示VEGF－C mRNA陽性組患者術后隨訪顯示生存率低于VEGF－C mRNA陰性組，提示VEGF－C與腫瘤預后相關，推測可能與其促進腫瘤淋巴轉移作用有關。

本組數據顯示VEGF－C mRNA的表達與食管鱗狀細胞癌浸潤及淋巴結轉移相關，并影響患者術后1年生存率，提示VEGF－C作為食管鱗癌血管和淋巴管新生過程中的重要因素，有望成為治療食管鱗癌新的、理想的“生物靶點”。通過抑制VEGF－C及其受體的表達以及兩者的結合，阻斷VEGF－C信號轉導通路，抑制腫瘤新生血管和淋巴管，達到抑制腫瘤浸潤和轉移的目的，有望降低食管鱗癌的淋巴轉移率，改善病人的預后。目前已有相關的藥物實驗在進行，并取得一定的成果［14］。

通過本實驗的結果，我們推測食管鱗癌腫瘤細胞產生的VEGF－C與其受體的胞外區特異性結合后，通過空間變構誘導細胞內酪氨酸殘基自身磷酸化，并啟動細胞內信號轉導而發揮生物學效應，促進血管內皮細胞分裂與增殖，增加血管通透性，使腫瘤更易浸潤到深部組織。同時通過受體介導的途徑誘導淋巴管內皮細胞增殖、新生淋巴管形成，新生腫瘤淋巴管由于其特殊結構，淋巴管通透性上升，腫瘤細胞就易于侵入淋巴管并形成遠處淋巴結的轉移。但是食管鱗癌的浸潤和淋巴轉移的發生是一個多因素參與和協同作用的結果，其機制尚未完全明了。本實驗僅從食管鱗癌VEGF－C mRNA這一因子觀察，其結果僅能對解釋食管鱗癌發生、發展與淋巴轉移的機制提供參考。準確機制的闡述仍需要進一步臨床及基礎實驗的證實。

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