共培養環境中兔角膜內皮細胞誘導人iPSCs分化*

譚美華， 陳建蘇， 招志毅， 丁 勇， 鐘敬祥， 戴 應， 李善義， 楊皓莊

(暨南大學1第一臨床醫學院眼科，2醫學院眼科研究所，3再生醫學教育部重點實驗室，4醫學院病理生理學系，廣東廣州510632)

人體內角膜內皮細胞(corneal endothelial cells，CECs)形成成熟單細胞層后一般失去增殖能力，在受到損傷和丟失后主要靠周邊內皮細胞的擴大和移行修復，而供體材料匱乏和免疫排斥反應使角膜移植治療角膜內皮疾病受到限制［1］。2006年，Takahashi等［2］首次將小鼠成纖維細胞體外重編程為類似胚胎干細胞的誘導多能性干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，這種體細胞來源的干細胞避免了道德倫理問題和免疫排斥的缺點，迅速成為干細胞領域的研究熱點［3－4］。利用iPSCs作為種子細胞來源，構建組織工程角膜內皮為臨床治療角膜內皮疾病提供了新的思路。本實驗通過建立 iPSCs與兔CECs的混合共培養模式，用原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)結合倒置顯微鏡觀察共培養前后iPSCs的形貌和超微結構變化，初步探討混合共培養誘導iPSCs分化的表征變化;在此基礎上，用量子點對iPSCs進行標記示蹤，對共培養一定時間后iPSCs膜蛋白的表達變化進行檢測，研究此共培養體系促進iPSCs向角膜內皮樣細胞分化的潛能，為進一步研究iPSCs向CECs的分化提供實驗依據。

材料和方法

1 材料與試劑

人臍帶源iPSCs(中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院惠贈);mTeSR1培養基(WiCellTM研究所); Y27632(Sigma－Aldrich);高糖DMEM培養基(Gibco);兔抗人Oct4、Nanog和Sox2抗體 (Cell Signaling);兔抗人水通道蛋白1(aquaporin 1，AQP1)抗體、鼠抗人 CD34抗體和羊抗鼠 IgG抗體(Santa Cruz);鼠抗人CD133抗體(Miltenyi Biotec);兔抗人CD31抗體(博奧森);鼠抗兔IgG抗體(Chemicon);量子點活細胞示蹤試劑盒(武漢珈源);熒光顯微鏡(Leica);原子力顯微鏡(BioScope Catalyst);三維去卷積實時活細胞成像系統(熒光)(API－DVCore);倒置顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 兔CECs的分離與培養 取新西蘭大白兔空氣栓塞致死，無菌條件下摘取眼球，PBS沖洗3次，放入含1×106U/L慶大霉素的PBS中，4℃冰箱浸泡30 min。環形剪下整片角膜組織，置于含5×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的雙抗PBS中，內皮面朝上，解剖顯微鏡下小心剝離后彈力膜和內皮層，移入無菌培養皿中，將卷曲大片的透明后彈力膜撕成小塊，雙抗PBS沖洗，加入0.25%胰蛋白酶常溫消化10 s，吸棄胰酶，加入內皮細胞培養基即含體積分數10%胎牛血清的高糖DMEM，反復吹打組織片50～60次，將懸液和后彈力膜一起移入6孔板，放入37℃、5% CO2培養箱中孵育。48 h后換液，以后每3 d更換1次培養基。細胞融合至80%時吸棄培養基，0.25%胰酶37℃消化10 min，內皮細胞培養基終止消化，反復吹打使細胞脫落，1 200 r/min、離心5 min，加入內皮細胞培養基重懸，1∶2傳代培養，做成爬片。

2.2 人iPSCs的擴增培養 37℃水浴箱解凍第31代人臍帶源iPSCs系［5］，轉移至15 mL離心管中，逐滴加入9 mL含體積分數0.1%Y27632的mTeSR1培養基，15～25℃、1 450 r/min離心5 min，棄上清，加入2 mL上述培養基，輕輕吹打重懸細胞，轉移至6孔板，放入37℃、5%CO2培養箱中孵育，24 h后改用mTeSR1培養基換液。每天倒置顯微鏡觀察，辨認克隆周邊分化的細胞并及時刮棄，保持高純度的未分化狀態iPSCs，每天更換培養基，5～7 d傳代。

2.3 人iPSCs的鑒定 收集1×106iPSCs裂解后的上清液，進行SDS－PAGE電泳。電轉移到PVDF膜上，洗滌液漂洗2 min，再將PVDF膜浸入5%封閉液中，4℃振蕩1 h，將PVDF膜分別與兔抗人Oct4、Nanog、Sox2抗體(1∶1 000)和兔單克隆β－actin抗體(1∶3 000)4℃孵育過夜，洗滌液洗滌3次，每次5 min，加入羊抗兔IgG抗體(1∶3 000)室溫孵育1 h，ECL法顯色，顯影劑孵育1 min，定影劑孵育0.5 min。2.4 人iPSCs的標記 未分化iPSCs擴增培養7 d后1∶4傳代，傳代后第4 d取3孔進行標記。根據量子點活細胞示蹤試劑盒說明書的步驟并調整濃度操作如下:分別取3 μL、4.5 μL和6 μL組分A，另取等體積組分B與組分A混勻，室溫孵育5 min，分別用594 μL、591 μL和588 μL mTeSR1培養基將A與B的混合液稀釋成應用液，量子點的濃度分別為5 nmol/L、7.5 nmol/L和10 nmol/L。取3孔iPSCs，吸棄培養基，PBS洗滌2次，分別加入配好的3種不同濃度應用液，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育1 h，吸棄標記液，PBS洗滌2次，加入mTeSR1培養基，置于孵箱繼續培養，每天換液，3 d后，用熒光三維去卷積實時活細胞成像系統觀察標記效果并拍照。

2.5 人iPSCs與兔CECs混合共培養 取3孔已用最佳濃度量子點標記的iPSCs，培養3 d后吸棄培養基，加入0.05%胰酶37℃消化3 min，吸走胰酶，mTeSR1培養基清洗2遍，加入mTeSR1培養基，用機械法輕輕刮起iPSCs，同時吹打幫助細胞脫落，分別取懸液的1/4、1/3和1/2加入到已經融合60%的兔CECs爬片中，均加入內皮細胞培養基，37℃、5% CO2培養箱中孵育培養，24 h后第1次換液，之后每2 d用內皮細胞培養基換液1次。

2.6 AFM觀察 共培養過程中，每天倒置顯微鏡觀察，記錄3種細胞的形態變化。7 d后，取最佳比例共培養的細胞，吸棄培養基，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，取出爬片自然風干，固定于AFM載物臺上，普通光選取要采集圖像的細胞，轉換為RTESP探針，以輕敲模式掃描。所用懸臂的彈性系數k為20～80 N/m，共振頻率為278～317 kHz，掃描速度0.5 Hz，圖像像素256×256 pixel，經自帶分析軟件進行3種細胞的全貌、細胞直徑、核直徑以及近核處5 μm小區域細胞膜的均方根粗糙度和平均粗糙度等參數的測量和分析。

2.7 免疫熒光檢測 以最佳比例混合共培養2周后，取4孔細胞吸棄培養基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min，配置的BSA－TBST室溫透膜30 min，10%胎牛血清封閉1 h，分別加入兔抗人CD31抗體、兔抗人AQP1抗體、鼠抗人CD133抗體和鼠抗人CD34抗體，4℃冰箱孵育過夜。PBS洗滌后，前兩者加入鼠抗兔IgG抗體，后兩者加入山羊抗鼠IgG抗體，均常溫孵育1 h，DAPI染色液室溫作用15 min，PBS清洗，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，取4孔正常培養7 d的iPSCs按相同的步驟染色作為對照。

結果

1 兔角膜內皮細胞生長形態

原代兔角膜內皮細胞分離培養48 h后大部分已貼壁，未被吹散的成團細胞貼壁后開始向周圍移行增殖，2周后細胞達80%融合，細胞呈多邊形，緊密排列呈鋪路石樣。傳代24 h后，角膜內皮細胞大部分貼壁，第3～5 d生長活躍(圖1)，1周達生長密集狀態，形態呈六邊形或橢圓形。

Figure 1.The morphology of primary rabbit corneal endothelial cells(CECs)cultured for 5 d(×100).圖1 兔角膜內皮細胞原代培養5 d的形態

2 人iPSCs的生長形態及鑒定

人iPSCs呈克隆生長，增殖較快，5～7 d可達90%融合。單個iPSC細胞核約占整個細胞的2/3，核漿比較大，可見2～3個核仁。Western blotting檢測顯示iPSCs的Oct4、Nanog和Sox2蛋白均表達陽性，見圖2。

Figure 2.The expression of Nanog，Oct4 and Sox2 detected by Western blotting.M:protein marker.圖2 Western blotting檢測Nanog、Oct4和Sox2蛋白的表達

3 人iPSCs的標記

量子點可標記共培養的人iPSCs，量子點熒光標記呈濃度正相關依賴，濃度為10 nmol/L的量子點應用液對iPSCs標記效果最佳，見圖3。

4 倒置顯微鏡觀察

共培養24 h后倒置顯微鏡觀察，iPSCs開始在CECs間隙貼壁克隆樣生長。1/3懸液的iPSCs貼壁克隆較多，細胞生長較快，小克隆逐漸融合，抑制CECs的生長;1/2懸液的iPSCs貼壁較多，融合形成的iPSCs大克隆顯著抑制內皮細胞的生長;1/4懸液的iPSCs生長良好，貼壁后的小克隆與角膜內皮細胞均繼續擴增，且新擴增的iPSCs體積逐漸變大，胞漿增多，兔CECs逐漸由六邊形變成橢圓甚至長梭形，見圖4。

5AFM觀察

用AFM對第1代兔CECs和共培養前后iPSCs作全貌及細胞膜小區域超微結構掃描，結果見圖5。圖5A是3種細胞的二維、三維和峰值誤差圖，可觀察到單層培養的第1代兔CECs表面粗糙，膜上分布著密集的大小不等顆粒狀突起物;共培養前iPSCs表面較光滑，未見明顯的顆粒;共培養7 d后iPSCs膜表面不再平滑，可見顆粒狀突起分布，粗糙度較前明顯增加。測量每個細胞及其細胞核的直徑，計算細胞核與細胞直徑之比，統計分析結果顯示3種細胞兩兩之間均有統計學意義(P＜0.05)，見圖5B，即iPSCs經共培養誘導后核漿比逐漸變小，說明iPSCs從形態上開始向內皮樣細胞轉化。取近核處細胞膜進行5 μm小區域超微結構掃描，發現共培養前后iPSCs均方根粗糙度Rq和平均粗糙度Ra比較均有統計學意義(P＜0.05)，見圖5C、D。共培養后iPSCs粗糙度較前明顯增加，與形貌圖的觀察結果一致。

Figure 5.The morphology of rabbit CECs and human iPSCs before and after mixed culture observed by atomic force microscopy.A:two－dimensional(2D)，three－dimensional(3D)and peak force error images;B:statistical chart of the ratio of diameter of diameter of nucleus to cell;C:statistical chart of the mean square root roughness(Rq);D:statistical chart of the average roughness(Ra).±s.n=20.*P＜0.05 vs CECs;△P＜0.05 vs iPSCs.圖5 原子力顯微鏡觀察兔CECs和共培養前后人iPSCs的形貌

6 免疫熒光檢測

混合共培養前iPSCs中CD31、AQP1、CD133和CD34蛋白均未見表達;共培養2周后，iPSCs表達AQP1呈陽性，見圖6，其它3種蛋白表達陰性。

Figure 6.Aquaporin 1 was expressed positively in human iPSCs after mixed－cultured with rabbit CECs for 2 weeks(under confocal microscope).圖6 分化后人iPSCs表達AQP1呈陽性

討論

目前，在特定條件下 iPSCs可被誘導分化為心肌細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞、神經元等［6－8］。將自體iPSCs作為組織工程角膜的種子細胞，利用其多向分化潛能，在特定條件下誘導分化為角膜內皮細胞，這一思路的可行性將為眼科臨床治療角膜內皮疾病提供新的途徑。

細胞共培養體系在維持細胞基本結構和性狀的基礎上，使體內外環境盡可能相吻合，有利于構建更加接近生理狀態的重建體外細胞組織。混合細胞共培養既有細胞因子的流通，又有細胞之間的接觸作用，是研究直接接觸共培養促進干細胞分化的一種有效方式［9－10］。原子力顯微鏡利用探針在樣品表面進行逐級光柵掃描得到樣品表面的形貌，它可在空氣或各種近生理條件的溶劑體系中直接觀測樣品表面形貌和結構特征，進行高精度的微觀測量，分辨率高，制樣簡單，操作性好，成像時間短，在生物醫學領域廣泛應用于細胞形態分析［11－12］。干細胞的標記對干細胞移植效果的評估和治療方案的優化極為重要，而功能化納米材料的標記技術是干細胞示蹤的新途徑。量子點作為一種新型熒光染料，它激發波長寬，發射波長窄，發光性能強，抗光漂白能力強，熒光壽命長，這些優良的光學和化學特性使得量子點成為生物醫學標記應用的一項重要技術［13］。在三維去卷積實時活細胞成像系統可以較好地顯示出量子點與膜表面蛋白雙標記效果。

本實驗用一種新的胰酶快速消化法分離培養出具有典型多邊形結構和鋪路石樣外觀的兔CECs，并用無飼養層細胞培養法擴增培養人iPSCs，避免了飼養層培養體系中可能出現的細胞混雜問題;倒置顯微鏡下及時挑走分化細胞以獲得保持未分化狀態的人iPSCs;對人iPSCs進行量子點標記示蹤，可以區別分化后的人iPSCs和兔CECs，且利于長期共培養后目的細胞的檢測和分選。設計了不同的細胞比例進行混合共培養，在最適宜條件下觀察兩者的相互影響和誘導效果。在倒置顯微鏡和AFM觀察到分化后的人iPSCs形態和膜粗糙度均發生變化，體積增大，胞漿增多，核漿比減小，細胞均方根粗糙度和平均粗糙度均增加。另外，本實驗選用CD34和CD133膜表面蛋白檢測是內皮干細胞的標志物，CD31也在內皮細胞連接處高表達，而AQP1是角膜內皮最主要的一個水通道蛋白［14］，結果顯示本實驗條件下iPSCs具有向角膜內皮樣細胞轉化的特征。

綜合這些結果，量子點標記共培養的人iPSCs呈濃度正相關依賴，10 nmol/L量子點標記的iPSCs以1/4懸液與融合60%的兔CECs共培養可獲得最佳混合共培養和標記效果。本實驗所用混合共培養方法可誘導人iPSCs從形態學變化上和AQP1表達上向角膜內皮樣細胞方向分化。產生這些變化的機制是兔CECs分泌細胞因子的誘導作用，還是2種細胞直接接觸作用，或是這兩者的雙重作用，還有待進一步觀察和研究。

［1］ Koay PY，Lee WH，Figueiredo FC.Opinions on risk factors and management of corneal graft rejection in the United Kingdom［J］.Cornea，2005，24(3):292－296.

［2］ Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cell from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126(4):663－676.

［3］ Tateishi K，He J，Taranova O，et al.Generation of insulin－secreting islet－like clusters from human skin fibroblasts［J］.J Biol Chem，2008，283(46):31601－31607.

［4］ Wernig M，Zhao JP，Pruszak J，et al.Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into thefetalbrain and improve symptomsofratswith Parkinson's disease［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(15):5856－5861.

［5］ Cai J，Li W，Su H，et al.Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells［J］.J Biol Chem，2010，285(15):11227－11234.

［6］ Schenke－Layland K，Rhodes KE，Angelis E，et al.Reprogrammed mouse fibroblasts differentiate into cells of the cardiovascular and hematopoietic lineages［J］.Stem Cells，2008，26(6):1537－1546.

［7］ Dimos JT，Rodolfa KT，Niakan KK，et al.Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons［J］.Science，2008，321 (5893):1218－1221.

［8］ Nishimura K，Nakagawa T，Ono K，et al.Transplantation of mouse induced pluripotent stem cells into the cochlea［J］.Neuroreport，2009，20(14):1250－1254.

［9］ Kingham PJ，Kalbermatten DF，Mahay D，et al.Adipose－derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro［J］.Exp Neurol，2007，207(2):267－274.

［10］ 蔣芳萍，張曉剛，丘 彥，等.成熟心肌細胞誘導胚胎干細胞定向分化為心肌樣細胞［J］.中國病理生理雜志，2009，25(5):1030－1033，1037.

［11］ Wildling L，Hinterdorfer P，Kusche－Vihrog K，et al.Aldosterone receptor sites on plasma membrane of human vascular endothelium detected by a mechanical nanosensor［J］.Pflugers Arch，2009，458(2):223－230.

［12］ 黃 艷，聶 偲，田玲玲，等.用原子力顯微鏡觀察術中失血回收對紅細胞形態的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28(2):380－384.

［13］ Walling MA，Novak JA，Shepard JR.Quantum dots for live cell and in vivo imaging［J］.Int J Mol Sci，2009，10 (2):441－491.

［14］ Li J，Kuang K，Nielsen S，et al.Molecular identification and immunolocalization of the water channel protein aquaporin 1 in CBCECs［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40(6):1288－1292.