FISH聯合multiplex RT－PCR檢測MLL基因重排的價值探討

何 易， 李旭東， 王東寧， 肖若芝， 王文文， 胡 元， 林東軍△

(中山大學1附屬第三醫院血液科，2血液病研究所，廣東廣州510630)

涉及11q23的染色體異常是造血系統腫瘤中常見的遺傳學改變，分子水平研究揭示此異常導致位于11q23的混合譜系白血病(mixed－lineage leukemia，MLL)基因發生重排，此基因亦被稱為 ALL1、HTRX、HRX或TRX1基因。MLL異常可分為兩類，一類為MLL重排，包括涉及MLL的易位、倒位和串聯重復序列(partial tandem duplication，PTD);第二類為MLL擴增，包括多倍體、均勻染色區(homogeneously staining region，hsr)和雙微染色體(double minutes，dmin)以及標記染色體(marker chromosome，mar)。WHO已將涉及11q23/MLL基因重排的急性白血病單獨列為11q23/MLL白血病，累及的白血病大多惡性程度高，對常規化療不敏感，生存期短，是預后差的獨立因素［1－2］，而早期進行造血干細胞移植可能為改善預后帶來好處［3－4］。因此，MLL基因重排的檢測對急性白血病(acute leukemia，AL)預后判斷和治療方案選擇具有重要意義。我們對201例已進行常規染色體核型分析(conventional cytogenetics analysis，CCA)的AL患者回顧性地總結熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization，FISH)和逆轉錄多重巢式聚合酶鏈反應技術(reverse transcriptionmultiplex nested PCR，multiplex RT－PCR)對MLL基因異常的檢出率，探討兩者聯合應用的價值。

材料和方法

1 研究對象

自2008年1月～2011年5月于我院住院并行常規CCA、FISH和multiplex RT－PCR檢測的原發AL患者共201例，包括急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者128例及急性淋巴細胞白血病(acute lymphoid leukemia，ALL)患者73例。共檢出19例MLL基因重排患者，其中13例為AML，按FAB分型M5 10例，M4 2例，M2 1例;6例為ALL。19例患者中男12例，女7例，中位年齡25.5 (2～68)歲。所有病例均進行形態學、免疫學、分子生物學和細胞遺傳學(MICM)分型。

2 方法

2.1 細胞遺傳學分析 取患者治療前骨髓3 mL，采用短期培養法培養骨髓24 h，終止培養前1 h加0.05 g/L秋水仙堿，按常規方法制備染色體，采用RHG顯帶技術進行核型分析，染色體核型描述參照ISCN2005的標準。

2.2 間期FISH檢測 采用染色體短期培養法的標本，氣干法滴片，并于2×SSC中洗片2 min，70%、85%、100%乙醇梯度脫水各2 min，加入MLL breakpoint探針(Cytocell)，實驗方法按說明書操作。橡皮水泥密封，37℃恒溫雜交儀過夜，次日洗片后用含0.1 mg/L二咪基苯基吲哚(DAPI)的抗褪色液復染標本10 min后在熒光顯微鏡下觀察，分析間期細胞200個。11q23/MLL基因重排陰性的細胞顯示2個黃色融合信號(0R0G2Y)，重排陽性的細胞顯示1個黃色融合信號和1個紅色及1個綠色信號(1R1G1Y)，MLL擴增顯示為3個以上的黃色融合信號。

2.3 中期FISH檢測 方法同間期FISH，選擇分散較好的中期分裂相在熒光顯微鏡下觀察MLL信號。

2.4 Multiplex RT－PCR檢測 取治療前EDTA抗凝的骨髓2 mL，采用 Trizol(Invitrogen)試劑提取(1～2)×106個有核細胞總RNA，用Maxima試劑盒(Fermentas)反轉錄為cDNA。MLL融合基因引物設計及檢測方法參照文獻［5］進行。2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀(Tanon 2500)軟件分析。共檢測11種較常見的MLL融合基因，包括:MLL/AFX、MLL/ AF1p、MLL/AF1q、MLL/AF4、MLL/AF6、MLL/AF9、MLL/AF10、dupMLL(11q23)、MLL/AF17、MLL/ELL和MLL/ENL。

3 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析，分類資料用χ2檢驗。

結果

1 間期FISH正常分界值的確定

正常分界值的計算為陰性對照組中所觀察到的陽性細胞數的均數±3×標準差。陰性對照組為10例經骨髓形態學確診的患者，包括特發性血小板減少性紫癜4例，缺鐵性貧血4例，大致正常骨髓象2例。間期FISH檢測該組陽性細胞百分率為1%～2.5%，均數為2%，標準差為0.51%，分界值=2%+ 3×0.51%=3.53%。將陽性細胞百分率大于該值的標本定為MLL基因重排陽性。

2 CCA、FISH和multiplex RT－PCR檢測結果

共有19例患者出現11q23/MLL基因重排，見表1。在AML中檢出13例(13/128，10.2%)，ALL中檢出6例(6/73，8.2%)。11例(11/201，5.47%)經CCA檢測到11q23異常，分別為:t(4;11)伴+11 1例，t(6;11)2例，t(9;11)2例，t(10;11)3例，t(11; 19)3例。FISH檢測見15例(15/201，7.46%)出現陽性MLL異常信號，其中11例為MLL分離信號，2例為擴增信號，同時出現分離和擴增信號的2例。第4例患者CCA正常，中期FISH見MLL分離的紅綠信號分別位于11號染色體的長短臂上，提示inv (11)，見圖1。18例患者(18/201，8.86%)檢出MLL融合基因陽性表達，分別為:dup MLL(11q23)6例，MLL/AF6 2例，MLL/AF10 3例，MLL/AF9 2例，MLL/ ELL 2例，MLL/ENL、MLL/AF4和 MLL/ELL伴 dup MLL(11q23)各1例，見表1。

表1 19例11q23/MLL基因重排陽性患者核型、FISH和PCR結果Table 1 .The results of karyotype，FISH and PCR in 19 MLL－positive cases

Figure 1.FISH results of the MLL probe.MLL gene exhibit yellow fluorescent.The break－apart of red and green signals stands for MLL rearrangement.圖1MLL探針的FISH結果

3 CCA與FISH、multiplex RT－PCR聯合檢測的比較

將CCA中無11q23重排的患者分為2組，一組為正常核型組，另一組為其它附加染色體異常組。5例正常核型組患者經FISH檢測1例為inv(11)，1例為MLL擴增;multiplex RT－PCR檢出4例dup MLL (11q23)。3例具有其它染色體異常的患者中1例為超二倍體，FISH檢測發現MLL擴增，1例 +8，FISH未發現異常，這2例患者multiplex RT－PCR檢出均為 dup MLL(11q23);第3例患者為四倍體，FISH檢測發現MLL重排并擴增，multiplex RT－PCR檢出MLL/ELL并dup MLL(11q23)，見圖2。FISH聯合multiplex RT－PCR檢出MLL異常率為9.45% (19/201)，較CCA檢出MLL異常率(5.47%)明顯提高，χ2=100.558，P＜0.01。19例MLL陽性的患者中，CCA敏感度為57.9%(11/19)，FISH敏感度為78.9%(15/19)，multiplex RT－PCR敏感度為94.7%(18/19)。

Figure 2.PCR results for MLL rearrangement.A:dup(MLL) positive product.Lane 1:MLLex5/MLLex2.B:MLL/ ELL(+)product.Lane 1，2:CBF/MYH11;Lane 3: MLL/AFX Lane 4:MLL/AF6;Lane 5:MLL/ELL.M:DNA marker.圖2MLL重排的PCR結果

討論

染色體易位是白血病常見的遺傳學改變，不同染色體或同一染色體不同區段易位后可造成2個基因融合，從而導致相應基因功能的異常獲得或喪失，使細胞發生惡性轉化并出現增生異常、分化障礙和凋亡減少。MLL易位、串聯重復和擴增等可造成HOX基因的持續表達而分化失控，導致造血干細胞惡變［6］。MLL重排是白血病重現性的遺傳學改變之一，具有MLL重排的急性白血病對常規化療反應差，對急性白血病的分型診斷、治療方案選擇和預后評價有指導意義，因此是急性白血病的常規檢查項目。CCA能全面分析人類23對染色體異常情況，是分析11q23重排的常用方法，但由于受染色體中期分裂相數量和質量以及染色體隱匿易位或PTD的影響，CCA將導致部分11q23異常漏檢。MLL重現性易位已達100種以上，已鑒定的伙伴基因達60多種［7］，龐大的易位種類也給CCA帶來一定的困難。本研究中CCA檢出11q23重排的敏感度為57.9%，而FISH和multiplex RT－PCR檢出MLL敏感度分別為78.9%和94.7%，提示CCA并非為檢測11q23/MLL重排的敏感方法。

FISH是結合了細胞遺傳學、分子生物學和免疫學的一種新技術，具有快速直觀、敏感性和特異性高、可重復性好等特點。間期FISH不受染色體質量的影響，可用于單細胞水平的直接觀察［8－9］。11q23/MLL易位的斷裂點絕大多數發生在8.5 kb的BamH I酶切片段、包含了外顯子5～11的斷裂集中區(breakpoint cluster region，BCR)，我們使用的11q23/MLL雙色分離信號探針正是以BCR為界線，用2個DNA片段以不同的熒光染料分別標記MLL基因斷裂集中區的中心粒端和端粒端。11q23/MLL雙色分離探針在間期細胞中易于觀察累及11q23/ MLL的各種易位、缺失和擴增而無需預先知道伙伴基因，但不能判斷倒位、插入和PTD。結合中期FISH則可明確易位的伙伴基因、倒位和插入。本研究中第4例患者CCA未見異常，于間期細胞中僅見分離信號，而中期分裂相上見MLL分離的紅綠信號分別位于11號染色體的長短臂上，證實為 inv(11)。FISH檢出的4例MLL擴增，包括多倍體和mar，CCA只報告了1例11三體和1例四倍體。這提示FISH能檢出CCA難以發現的MLL隱匿易位、倒位和擴增，其敏感性要高于CCA。

MLL與伙伴基因融合后轉錄出融合基因轉錄本，雖然涉及的伙伴基因眾多，但以MLLT2(AF4)、MLLT3(AF9)、MLLT1(ENL)、MLLT10(AF10)和MLLT4(AF6)出現頻率最高［10］。多數研究表明具有MLL基因重排的患者對常規化療反應差，預后不良，尤其年齡小于1歲的嬰幼兒治療效果更差［1－2］。PTD為MLL自身融合的形式，具有MLL－PTD的患者同樣生存期也較MLL－PTD陰性者短［11］。我們采用的multiplex RT－PCR方法中包含了MLL/AFX、 MLL/AF1P、MLL/AF1q、MLL/AF4、MLL/AF6、MLL/ AF9、MLL/AF10、MLL/AF17、MLL/ELL和 MLL/ENL等常見的融合基因，也包含了dupMLL(11q23)這種不能被CCA和FISH方法檢測出的串聯重復形式。本研究確定了12例MLL的伙伴基因，還檢出了7例dupMLL(11q23)，彌補了CCA和FISH的不足。

綜上所述，FISH的雙色分離探針能夠檢測間期細胞和中期分裂相上的MLL信號，無需預先知道伙伴基因，其檢測范圍大大高于multiplex RT－PCR;而multiplex RT－PCR能夠明確常見的MLL融合基因及其伙伴基因，還能檢出FISH無法測到的MLLPTD，兩者結合顯著提高了MLL重排的檢出率。

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